光周期诱导新铁炮百合成花转变的分子机理研究

发布时间：2020-11-02 13:58

　　百合(Lilium)是全球花卉交易市场上重要的高品质切花,新铁炮百合(Lilium×formolongi)是百合属中十分罕见的播种繁殖一年开花的优良品种,这一珍贵的开花特性对于百合的花期改良育种十分重要。之前的研究表明,光周期对新铁炮百合成花转变的影响十分显著。但由于百合属植物基因组庞大,遗传背景十分复杂,目前百合的成花调控分子机理尚不十分清楚。因此,探究光周期诱导新铁炮百合成花转变的分子机理具有下列重要意义:从光周期途径揭示了新铁炮百合“早熟开花”的分子遗传调控机理,缩短育种周期,为培养短生育期的百合新品种提供分子理论基础;阐明了百合光周期成花诱导的分子机理,构建了基因调控网络;为百合的成花遗传调控分子机理研究增加宝贵的基因数据资源。本研究在分析表型性状、解剖结构和基因表达等指标的基础上,确定了长日照下新铁炮百合成花诱导过程中的关键节点。并利用转录组测序技术,构建了新铁炮百合成花诱导的基因调控网络,挖掘了一些光周期成花诱导的重要调控基因。并且重点对新铁炮百合CONSTANS-LIKE(COL)基因家族的8个成员进行了序列进化、转录表达及功能验证研究,确定了起关键成花诱导作用的LfCOLs成员。主要研究结果如下:(1)新铁炮百合实生苗是兼性长日照植物。长日照条件极大促进了新铁炮百合的成花转变,植株开花时间比短日照条件下早近4个月,开花率高60-70%。新铁炮百合一年开花的性状遗传自亲本台湾百合(L.formosanum),另一亲本麝香百合(L.longiflorum)在一年的生长周期中不能开花。新铁炮百合对光周期敏感的开花特性是可以遗传的,获得了新铁炮百合自交系花期分离群体,其中早花群体的花期平均比中花群体早1个月,比晚花群体早2个月。此花期分离群体是今后研究新铁炮百合光周期成花诱导分子机制的优良群体材料(2)通过表型性状调查,茎尖石蜡切片解剖形态观察以及CONSTANSCO/FLOWERING LOCUS T(CO/F)同源基因的昼夜节律表达情况,确定了长日照条件下,新铁炮百合成花转变过程的关键时期及形态指标,包括幼龄期(播种后至7-8片叶)、诱导期(抽葶前后)、成年期(5-6节间)及分化期(9-10节间)。在茎尖尚处于营养生长状态时,CO/FT同源基因的昼夜节律表达模式可作为新铁炮百合进入成花诱导期的重要分子指标。(3)幼龄期、诱导期、成年期和分化期叶片和茎尖转录组测序共获得52,824条高质量的Unigene序列,其中33,652条(63.71%)Unigene获得了功能注释。四个时期的表达谱共获得了 37,032个差异表达基因,大部分差异表达基因显著呈现出从幼龄期至诱导期上调表达,诱导期至成年期下调表达,成年期至分化期再次上调表达的时空表达模式。本次测序一共发现了 87个与成花相关的同源基因,其中52个编码转录因子,包括 bHLH,bZIP,RAV,MYB,Dof,CO-like,MADS-box 等转录因子家族。这些成花相关的差异表达基因分布在6条成花调控途径中,有41个(48.8%)属于光周期成花调控途径。其中包括重要的成花调控因子GIGANTEA(GI),COL,FT等。在此基础上,构建了新铁炮百合成花诱导的基因调控网络。(4)利用RACE技术鉴定得到了 8个LfCOL基因家族成员的编码区全长,根据蛋白氨基酸序列保守结构域的不同,可以分为3类,类型Ⅰ为LfCOL5,具有两个B-boxes保守结构域;类型 Ⅱ 包括LfCOL6,LfCOL7,LfCOL13,LjCOL14,LfCOL15和LfCOL16,具有一个B-box保守结构域;类型Ⅲ是LfCOL9,具有一个正常的B-box保守结构域,以及一个二级结构发生改变的B-box保守结构域。其中LfCOL5与拟南芥CO基因同源性最近,保守结构域结构也最为相似。(5)8个LfCOL基因家族成员及LfFT1基因在不同光周期条件下的时期表达及昼夜表达模式结果表明,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9、LfFT1在长日照条件下新铁炮百合成花诱导期高表达,但在短日照条件下呈现截然不同的时期表达模式。并且,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9在长、短日照条件下都连续三天呈现有规律的昼夜振荡表达模式,长日照条件下,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9的昼夜节律表达模式与拟南芥CO基因一致。试验结果表明新铁炮百合长、短日照条件下的成花诱导遗传调控机制不同,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9基因可能在长日照成花诱导中发挥重要作用。(6)分别构建了L、j℃OL5LfCOL6、LfCOL9基因的植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥co晚花突变体,结果表明,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9都能够促进拟南芥晚花突变体提前开花,转LfCOLs基因的株系,平均开花时间比co晚花突变体早12-13天,比野生型早6-7天;平均莲座叶数目比co晚花突变体少12-14片,比野生型少5-6片。并且,转Lf℃OLs基因的株系刚抽葶时叶片中AtFT基因的表达水平都高于拟南芥co突变体。因此确定LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9基因是长日照诱导新铁炮百合成花转变的重要促进因子。尤其是LfCOL6、LfCOL9基因是新铁炮百合中特有的能促进成花诱导的基因。体现了新铁炮百合LfCOL基因家族在系统发育、进化及基因功能方面具有特异性。以上研究结果对阐释光周期诱导新铁炮百合成花转变的分子机理具有重要的理论意义,获得的开花关键基因,对百合花期改良分子育种及培养生育期短的百合新品种具有重要的实际应用价值。
【学位单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S682.29
【部分图文】：

模式图,基因遗传,拟南芥,模式图

?Ｕｊｓ???（Ｔｕｒｃｋ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。在茎尖，ＦＴ?蛋白质与?ｂＺＩＰ?转录调控因子?ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ?ＬＯＣＵＳ?Ｄ??（ＦＤ）共同作用，并促进ＭＡＤＳ－ｂｏｘ转录因子基因ａＦ??ＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ?ＯＦ?ＣＯＮＳＴＡＮＳ?１?（ＳＯＣＰ）、ＡＰＩ、ＦＲＵＩＴＦＵＬＬ（ＦＵＬ）的轰达，队??而调控成花转变及花器官发育〇＾＾６１３１．，２００５；＼＾§８６?６１３１．，２００５）（图１－１）。但是尸７??基因的表达同时也受到了几个调控因子的抑制，这些抑制因子通过不同的作用机制和??成花调控途径抑制，７＇的表达，从而阻止植物过早的开花（丫３１？６１＆１．，２００９）（图１－１）。??这些抑制因子包括ＲＡＶ转录调控因子ＴＥＭＰＲＡＮＩＬＬＯ?１?（ＴＥＭ１）、ＴＥＭＰＲＡＮＩＬＬＯ?２??（ＴＥＭ２），具有?ＡＰＥＴＡＬＡ２?（ＡＰ２）结构域的蛋白质?ＴＡＲＧＥＴ?ＯＦ?ＥＡＴ?１－３?（ＴＯＥ１－３）、??ＳＣＨＬＡＦＭＵＴＺＥ?（ＳＭＺ）及?ＳＣＨＮＡＲＣＨＺＡＰＦＥＮ?（ＳＮＺ）?（Ａｕｋｅｒｍａｎ?ａｎｄ?Ｓａｋａｉ，?２００３；??Ｊｕｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２００７；?Ｍａｔｈｉｅｕ?ｅｔ?ａｌ．，?２００９）。以及具有?ＭＡＤＳ?结构域的转录因子??ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ?ＬＯＣＵＳ?Ｃ?（ＦＬＣ）?（Ｓｃｈｍｉｄ?ｅｔ?ａｌ．，２００３）（图?１－１）。??

昼夜节律,光周期,途径,时分

促进ＣＤＦ１的蛋白质的降解，从而解除ＣＤＦ１对Ｃ０的抑制作用，在一天中的傍晚出??现表达高峰（Ｆｏｍａｒａ?ｅｔ?ａｌ．，２００９；?Ｓａｗａ?ｅｔ?ａｌ．，?２００７）（图１－３Ａ）。但是在短日照条件下，??黎明后１０－１２?ｈ己经进入黑暗条件，ＧＩ不能与ＦＫＦ２形成蛋白复合物，ＣＯ基因受到??ＣＤＦ１的抑制作用，因此在傍晚时分不能出现高峰（Ａｎｄｒ６ｓ?ａｎｄ?Ｃｏｕｐｌａｎｄ，?２０１２）。??ＣＯ基因在傍晚时分出现的转录表达高峰对维持ＣＯ蛋白质的稳定非常重要。在??夜间黑暗条件下，ＣＯ蛋白质会被ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＶＥ?ＰＨＯＴＯＭＯＲＰＨＯＧＥＮＩＣ?１??（ＣＯＰｌ）－ＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ?ＯＦ?ＰＨＹＴＯＣＨＲＯＭＥ?Ａ（ＳＰＡ１）泛素连接酶复合物降解，因此??基因在黑暗条件下出现的表达高峰并不能维持ＣＯ蛋白质的稳定（Ａｎｄｒｄｓ?ａｎｄ??Ｃｏｕｐｌａｎｄ，?２０１２）（图１－３Ｃ）。在傍晚时分，光照条件下，光敏色素基因能够解除ＣＯＰ１－??ＳＰＡ１复合物对ＣＯ蛋白质的降解作用。隐花色素受体ＣＲＹＰＴＯＣＨＲＯＭＥ?２?（ＣＲＹ２）（蓝??光受体）与ＣＯＰ１相互作用，并且抑制ＣＯＰ１的表达（Ｗａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２００１；?Ｙａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，?２０００；??Ｚｕｏ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１），光敏色素受体ＰＨＹＡ?（远红光受体）也能对ＣＯＰ１－ＳＰＡ１复合物起到??抑制作用（图１－３Ｃ）。同时，ＦＫＦ１在光照下也能与ＣＯ蛋白质互相作用，增强ＣＯ蛋??白的稳定性（Ｓｏｎｇ?ｅｔａｌ．，２０１２）。因此只有长日照条件下，基因在傍晚时分出现的表??达高峰能维持ＣＯ蛋白质的稳定，并进一步促进厂７基因的表达，从而诱导开花。??

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