葡萄连作土壤中有害菌的分离鉴定与验证

发布时间：2020-11-09 04:11

　　 连作土壤中有害菌的激增是导致连作障碍的主要原因,为了探究引发葡萄连作障碍的主要有害菌,本试验以不同地区的连作土壤为研究对象,采用传统的稀释平板法和高通量测序技术,探究了连作对葡萄根际土壤细菌和真菌种群结构的影响;分离、鉴定了不同地区葡萄连作土壤中优势细菌和真菌,进一步采用盆栽试验验证了主要优势真菌的致病性,主要试验结果如下:1.分离鉴定了葡萄连作土壤中的优势细菌和真菌。通过传统的平板法在辽宁沈阳、熊岳、锦州三个地区的4个葡萄连作园土壤中鉴定出优势细菌43株,分别属于7个属,即假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium sp.)、剑菌属(Ensifer sp.),其中假单胞菌属(Pseudomonas sp.)数量最多,其次为芽胞杆菌属(Bacillus sp.)。鉴定出优势真菌42株,分别属于11个属,即孢子丝菌属(Sporothrix sp.)、粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)、毛霉属(Mucor sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、枝孢菌属(Cladosporium sp.)、镰孢菌属(Fusarium sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)、未培养的接合菌(uncultured zygomycete)、葡萄球菌属(Stagonosporopsis sp.)、孢霉属(Mortierella sp.)。2.连作改变了土壤细菌和真菌的种群结构。通过16S rDNA测序共鉴定出13种不同属细菌。与对照相比,地杆菌属(Pedobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、德奥斯氏菌属(Devosia)、红游动菌属(Rhodoplanes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Steroidobacter的含量显著升高;而丰祐菌属(Opitutus)含量显著降低;黄杆菌属(Flavobacterium)、金黄杆菌(Chryseobacterium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)和Kaistobacter在连作土壤中含量显著升高(除XY之外)。通过18S rDNA测序共鉴定出12种不同属真菌,其中枝孢霉属(Cladosporium)、Mrakiaceae(XY除外)、Xanthomendoza(XY除外)的含量在连作土壤中显著升高;链格孢属(Alternaria)在BZ连作土壤显著升高;镰孢菌属(Fusarium)在SY连作土中显著升高;毛壳霉(Chaetomium)、亚隔孢壳属(Didymella)和锥毛壳属(Coniochaeta)含量显著低于对照。3.验证了三种优势真菌的致病性。对细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)、细孢枝孢(Cladosporium perangustum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)三种优势真菌的致病性进行了验证。盆栽土壤接入三种菌种后,贝达葡萄((V.riparia×V.labrusca cv.Beta)实生苗叶片感病,在接种的第12 d时开始出现死亡现象,致病性显著。4.测定了三种优势真菌在连作土壤中的绝对含量。结果表示链格孢菌(Alternaria)在BZ连作土壤中的绝对含量显著高于空白土壤;枝孢菌(Cladosporium)在连作土壤中的绝对含量显著升高(BD除外);镰孢菌(Fusarium)在葡萄连作土壤中的绝对含量均显著高于空白土壤。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S663.1
【部分图文】：

本试验通过样品的稀疏曲线及Venn图来说明测序深度与准确度。通常用稀疏曲线（rarefaction curve）来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并且能够间接的反映出样品中物种的丰富程度。如图2-2所示，随着选取的样品个数增加，样品的稀疏性曲表 2-4 16S rDNA 扩增子测序 Tags 详细信息统计表Table 2-4 Statistical table of Tags detailed information for 16S rDNA amplifier sequencingSample Effective Base（pb） AvgLen（pb） Q20 Q30BZ1 49336 18357863 372 97.34 94.40BZ2 50864 18918716 372 97.36 94.44BZ3 34462 12838095 373 97.35 94.39BD1 48493 18072773 373 97.32 94.34BD2 43443 16188538 373 97.19 94.09BD3 47916 17880072 373 97.16 94.98SY1 47584 17724717 372 97.38 94.47SY2 22888 8515877 372 97.35 94.44SY3 37705 14026434 372 97.41 94.55XY1 44703 16729906 374 99.50 98.09XY2 3933 16441725 374 99.80 99.24XY3 50399 18864493 374 99.46 97.90CK1 49166 18423637 375 99.42 98.33CK2 53531 20049714 375 99.32 97.18CK3 48911 18329092 375 99.19 98.00

Fig.2-2 Rarefaction curves of each soil samples at97% similarity图2-3 不同土壤细菌OTUs venn 图Fig.2-3 OTUs venn of soil bacteria indifferentSamples注：WSX1-3~WSX13-15分别表示BZ、BD、SY、XY、CKNote: WSX1-3~WSX13-15 denotes BZ, BD, SY, XY, CK,respectively2.2.2.2 连作对不同地区葡萄土壤根际细菌群落结构的影响通过样品非加权配对平均法聚类分析（UPGMA）及主坐标分析（PCoA），来研究不同地区连作葡萄根际土壤中细菌群落结构的变化。如图 2-4 所示：样品 UPGMA 聚类分析是基于 beta-diversity 矩阵对土壤样品进行聚类的方法，红色枝表示 bootstrap 的支持度为 75～100%。两个样品的距离越近则表示相似度越大，反之亦然。对土壤中细菌进行测序后结果表明 XY 与其它连作土壤分为两个矩阵，说明 XY 地区土壤细菌群落结构与其它连作土壤和CK差异较大，而CK与除XY以外的其它连作土壤也分为两个矩阵。说明连作改变了土壤中细菌群落的结构。图 2-4 不同土壤样品中细菌 UPGMA 聚类分析Fig.2-4 PGMA cluster analysis of bacteria in different soils

似度为 97%条件下土壤样品的稀释曲线arefaction curves of each soil samples at97% similarity图2-3 不同土壤细菌OTUs vennFig.2-3 OTUs venn of soil bacterdifferentSamples注：WSX1-3~WSX13-15分别表示BZ、BD、SY、Note: WSX1-3~WSX13-15 denotes BZ, BD, SY, XYrespectively连作对不同地区葡萄土壤根际细菌群落结构的影响样品非加权配对平均法聚类分析（UPGMA）及主坐标分析（PCoA）连作葡萄根际土壤中细菌群落结构的变化。如图 2-4 所示：样品 UPG于 beta-diversity 矩阵对土壤样品进行聚类的方法，红色枝表示 bootstr～100%。两个样品的距离越近则表示相似度越大，反之亦然。对土壤结果表明 XY 与其它连作土壤分为两个矩阵，说明 XY 地区土壤细菌作土壤和CK差异较大，而CK与除XY以外的其它连作土壤也分为两改变了土壤中细菌群落的结构。
【参考文献】

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本文编号：2875865