菌酶协同发酵制备低抗原性豆粕工艺的研究

发布时间：2020-03-31 03:25

【摘要】：豆粕是大豆提取豆油后的一种副产品,其蛋白质含量高达43%~46%,并且富含异黄酮、磷脂等生物活性物质以及脂肪、糖类、矿物质等营养成分,是一种非常优质的畜禽植物蛋白饲料原料。但由于豆粕中含有抗原蛋白,会引起幼龄动物发生过敏反应,症状表现为腹泻、肠道炎以及生长停滞等,甚至导致动物死亡,在一定程度上限制了其在幼畜饲料中的应用,因此降低豆粕中的抗原蛋白活性是近年来国内外动物营养学研究的热点。目前,发酵豆粕和酶解豆粕以其营养价值高、富含活性成分、生产成本低且安全无污染的特性正越来越受到青睐。本论文拟通过将微生物发酵和蛋白酶水解相结合的方法,探寻一种低抗原豆粕的加工方法。本论文主要分为三个部分:(1)通过SDS-PAGE、水解度、ELISA等指标筛选出降解抗原蛋白效果最佳的益生菌;(2)通过SDS-PAGE、水解度、ELISA等指标筛选出降解抗原蛋白效果最佳的蛋白酶;(3)通过响应面法确定菌酶协同发酵豆粕的最佳条件。其主要的研究方法及结论如下:(1)采用不同的提取方法提取豆粕中的蛋白质,以发酵豆粕中蛋白质电泳条带完整性为筛选指标,选出较好的蛋白质提取方法为:称取磷酸二氢钾(KH_2PO_4·2H_2O)1.2g、磷酸氢二钠(Na_2HPO_4·12H_2O)14.5g,用蒸馏水溶解并定容至1000mL,取定容后的溶液100mL,加入48g尿素、0.31gDTT溶解后制成变性提取缓冲液,在80℃预热5min,取6mL向其中加入1g豆粕,超声提取60min,离心,取上清液,在截留分子量3500Da的透析袋中透析过夜,收集蛋白。(2)采用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉发酵豆粕,根据料水比的不同分为固态发酵和液态发酵。通过SDS-PAGE电泳分析蛋白条带、OPA法测定确定豆粕蛋白水解程度、水解物中大豆抗原蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)定量检测和ELISA检测这两种抗原蛋白的抗原性变化。结果表明,最佳的发酵菌种为枯草芽孢杆菌,发酵条件为料液比1:1,菌接种量为1mL 1×10~8cfu/mL菌液,37℃发酵12h。此时豆粕的水解度为3.88%,豆粕中的大豆球蛋白的降解率为82.4%,β-伴大豆球蛋白的降解率为88.5%。经总氨基酸含量测定,枯草芽孢杆菌固态发酵12h后豆粕中的必需氨基酸含量约为194mg/g。(3)采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶水解豆粕,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白条带、OPA法确定豆粕蛋白水解程度、大豆抗原蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)定量检测和ELISA检测这两种抗原蛋白的抗原性变化。结果表明,按照底物质量的0.5%添加胃蛋白酶,在pH为2,37℃下水解60min为最佳反应条件。此时豆粕的水解度为10.7%,豆粕中的大豆球蛋白降解率为79.3%,β-伴大豆球蛋白的降解率为87.6%。经总氨基酸含量测定,胃蛋白酶水解60min后豆粕中的必需氨基酸含量约为170mg/g。(4)用响应面法优化枯草芽孢杆菌和胃蛋白酶协同发酵制备低抗原性豆粕的条件,得到最佳的发酵条件为豆粕中添加0.825%豆粕质量的胃蛋白酶,调整pH为2后,在37℃下酶解88.2min,此后,往培养基中接入1mL浓度为1×10~8cfu/mL单位不对的枯草芽孢杆菌,在37℃培养箱内静置发酵17.52h,此时大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解率分别为78.6%和40.5%。
【图文】：

过敏反应,大豆,机制,血液循环系统

大豆过敏反应机制过敏反应

电泳图,豆粕,固态发酵,菌种

2 豆粕经不同菌种固态发酵 6h 后经 PBS 提取得到的蛋白提取液的 SDS-ig.3-2 SDS-PAGE diagram of protein extract obtained from soybean meal afterfermentation of different strains for 6h and PBS extraction 蛋白 marker；2 原豆粕；3-7 依次为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米h 对水解豆粕中抗原蛋白条带的电泳图。通过五种菌发酵后蛋白的蛋白条带对比可以看出，五种菌发酵后的蛋白跑道上基本看不明这五种菌在固态发酵 6h 后基本将豆粕中的大豆抗原蛋白水解的短肽连。由于跑道颜色过深，可能只存很少一部分的碱性亚基条带中看不出明显的差异，，需结合水解度一起分析。140756045351 2 3 4 5 6 7
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.1;TS229

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