新型琼脂采样膜的制备及其在大气细颗粒物肝细胞毒性研究中的应用

发布时间：2020-05-04 09:57

【摘要】：空气污染由自然界和人类活动产生的物质成分混合而成。大气颗粒物(Atmospheric particulate matters,PM)是空气污染物的主要成分之一,也是影响我国城市空气质量的主要污染物之一。大气颗粒物污染已经成为威胁人类健康的重要因素,尤其是空气动力学直径小于2.5 μm的PM2.5更被认为与多种重大呼吸、代谢等疾病的发生、发展密切相关。目前对于大气颗粒物的采集最常用的方法是滤膜采集法和分级采集法。采集大气颗粒物常用的采样膜有聚四氟乙烯(特氟隆)膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜、石英膜等,然而目前常用的采样膜存在本底干扰强,提取效率低等缺点,不能完全适用于细胞实验。本实验针对目前采样膜的缺点,探索用生物兼容的琼脂培养基制成的膜代替撞击式大气颗粒物采样器的常规滤膜,使颗粒物撞击到软性的琼脂膜上,将含有大气颗粒物的琼脂膜直接暴露细胞,开发了一种新型低扰动、低破坏的采样方法。本研究采用人肝癌细胞HepG2和人正常细胞HL7702作为体外模型,观察琼脂膜与特氟隆膜在同等条件下的采集颗粒小于2.1μm的大气PM2.1对肝细胞活力、氧化应激,凋亡,蛋白组学的影响,评价在两种处理方式下PM2.1对这两种肝细胞的毒性作用。主要内容如下:1)通过冷冻干燥法制备琼脂采样膜,选择了 1%的琼脂凝胶浓度和冰箱缓慢冷冻的最佳制膜条件,利用SEM,ATR-FTIR等一系列表征手段表征了琼脂采样膜的结构特征。并利用SEM-EDX、ATR-FTIR、离子色谱、ICP-OES,GC-MS等方式表征采样膜上的大气颗粒物,验证了琼脂采样膜与传统采样膜(特氟隆膜等)在大气颗粒物采集效率的一致性,探索了琼脂采样膜在大气颗粒物采集中的独特优势,验证了琼脂采样膜在大气颗粒物采集方面的可行性。2)分别利用琼脂膜与特氟隆膜采集南京某地区大气中的大气细颗粒物PM2.1,首先用CCK-8法检测两种膜上细颗粒物不同处理方式刺激对HepG2细胞和HL7702细胞的活力,确定为50,100,200λg/mL作为琼脂组的刺激浓度,100,200,400μg/mL作为特氟隆组的刺激浓度。通过蛋白组学iTRAQ研究刺激后对细胞整体组学的改变,进一步分析两种膜的优劣及细颗粒物对细胞的毒性作用差异。通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细颗粒物刺激24h后细胞的凋亡情况以及运用Real-time PCR法及Western Blot法检测Bax、Bcl-2和Caspase3的mRNA和蛋白表达量情况,分析肝细胞凋亡的原因是Bcl-2/Bax 比值的变化以及Caspase3的活化,而这一过程可能是由细胞高氧化压力导致。采用流式DCFH-DA荧光探针法检测细颗粒物刺激细胞24h,发现随着颗粒物浓度提高,细胞活性氧也随之提高。通过酶标法检测细颗粒物刺激24h后细胞内总SOD、CAT酶活力下降和MDA含量上升,显示细颗粒物刺激后诱导细胞产生氧化应激;运用Real-time PCR法及Western Blot法检测细颗粒物刺激24h后两种细胞Nrf2、HO-1和KEAP1的mRNA和蛋白表达情况,可知细胞通过上调HO-1蛋白表达和自我泛素化KEAP-1通路来应对氧化压力。对比细胞活力、细胞凋亡等结果,发现相同浓度下琼脂组的毒性大于特氟隆组;同一浓度相同组下HL7702比HepG2更容易凋亡。琼脂组毒性更大的原因可能与直接提取方式以及琼脂膜本身易吸附大气中的有机物质、内毒素等有关;而HL7702作为人正常细胞往往比人肝癌细胞更加敏感。
【图文】：

颗粒物逡逑污染由自然界和人类活动产生的物质成分混合而成。大气混合污染主染源排放的气态和颗粒态一次污染物以及其在扩散中经过系列物理、成的二次细颗粒物和臭氧等二次污染物组成。大气颗粒物是大气中存态和液态颗粒状物质的总称。各种颗粒状物质均匀地分散在大气中构稳定的庞大的悬浮体系，即气溶胶体系，，因此大气颗粒物也称为大气ｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ邋ａｅｒｏｓｏｌｓ）邋ｍ。大气颗粒物根据尺寸（空气动力学当量直径以下几类［２］：邋１）邋ｌ00（ｉｍ以下的颗粒成为总悬浮颗粒物（Ｔｏｔａｌｓｕｓｐｅｎｄｔｅ，ＴＳＰ）：邋２）邋ｌＯｐｍ邋以下的颗粒被称为可吸入颗粒物（ＴｈｏｒａｃｉｃｐａｒｔｉｃｕｌａｔＭ１０）；邋２）邋２．５邋ｊａｍ邋以下的颗粒被称为细颗粒物（Ｆｉｎｅ邋ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ邋ｍａｔｔ；邋４）邋０．１邋（ｉｍ以下的颗粒被称为超细颗粒物（Ｕｌｔｒａｆｍｅ邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，邋ＰＭ０．１

图１．２滤膜采样器过滤头示意图逡逑．紧固圈；３．密封圈；４．接座圈；５．支撑网；６．滤膜；７．抽ｕｒｅ邋１．２邋Ａ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｅａｄ邋ｏｆ邋ｆｉｌｔｅｒ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｓａｍｐｌｅｒ＾逡逑ｅ；邋２．邋ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ邋ｒｉｎｇ；邋３．邋ｓｅａｌ邋ｒｉｎｇ；邋４．邋ｓｅａｔ邋ｒｉｎｇ；邋５．邋ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ邋ｎ６．邋ｆｉｌｔｅｒ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ；邋７．邋ｅｘｈａｕｓｔ邋ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）逡逑积法。利用颗粒物的重力、空气动力和浓度扩散作用自然沉积法不需要动力设备，简单易行，且采样时间长，尺寸分级难以把握，不能反映粒径对毒性的影响。逡逑样法。安德森级联撞击式采样器广泛应用于评估空气可以将不同尺寸的大气颗粒物分别采集到不同的采样尺寸大气颗粒物的理想采样装置之一（如图１．３）。其基的气流经过切割到每一级撞击盘时，其中较大的颗粒物
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ051.893;X513

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本文编号：2648371