精氨酸脱亚胺酶在红曲中的表达

发布时间：2020-05-29 21:34

【摘要】：L-瓜氨酸(L-citrulline)是一种α氨基酸,具有抗疲劳、抗衰老、提高免疫力和提升男性性功能等活性,在医药、保健品行业应用广泛。L-瓜氨酸可以由精氨酸脱亚胺酶(Arginine Deiminase,简称ADI)转化L-精氨酸得到。红曲霉(Monascus)是一种重要的工业微生物发酵菌,在食品、药品和保健品领域有巨大的应用潜力,其发酵产物具有调节血脂、血压的功能,对糖尿病、帕金森病等多种疾病有较好的预防和治疗效果。本课题采用根瘤农杆菌介导的转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),将外源ADI基因随机插入红曲霉基因组中,构建了一种胞内组成型表达ADI的红曲霉工程菌。此工程菌可以用于L-瓜氨酸的生产及红曲相关保健品的开发。本课题采用无缝克隆技术将支原体来源的ADI基因与线性化微型Ti载体p CAMBIA-Pgpd A-Tcbh1-hph-Ptrp C进行连接,连接产物转化至克隆宿主大肠埃希氏菌E.coli DH5α;提取转化子质粒,经基因测序筛选出阳性转化子。至此,用于胞内组成型表达ADI的微型Ti载体p CAMBIA-Pgpd A-ADI-Tcbh1-hph-Ptrp C已构建完成。采用多种条件制备根瘤农杆菌感受态细胞,将微型Ti质粒转化根瘤农杆菌,结果表明采用50 mmol/L Ca Cl2制备的根瘤农杆菌感受态细胞转化子数量最高。采用该条件将微型Ti质粒转化至根瘤农杆菌中,PCR鉴定阳性转化子。将红曲霉孢子悬浮液与根瘤农杆菌转化子于24℃共培养,培养48 h后转移至筛选培养基中。将筛选培养基中的红曲霉抗性菌落用PDA液体培养基培养,培养液用薄层色谱法和二乙酰一肟法检测L-瓜氨酸生产情况。提取能产生L-瓜氨酸的红曲霉转化子基因组进行PCR鉴定,并研究其遗传稳定性。最终得到两个转化子:6号菌与7号菌,性状与野生型红曲霉相近,PCR鉴定ADI基因已成功插入至红曲霉基因组中,证明胞内组成型表达ADI的红曲霉工程菌构建成功。
【图文】：

11图 2-1 质粒构建技术路线图Fig. 2-1 Strategy for construction of plasmids2.3 实验准备2.3.1 实验仪器实验过程中使用的主要设备和仪器列于表 2-1

浙江工业大学硕士学位论文少有 16 bp 引物与模板互补配对。1-F 5’-AGCTCCGTGGCGAAAGCCTGAC-R 5’-CATTGTGATGTCTGCTCAAGCGG的二级结构预测见图 2-2 和图 2-3：
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ922

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 蓝晶晶;吴伟杰;王建中;;西瓜皮中L-瓜氨酸含量测定及提取技术研究[J];黑龙江农业科学;2016年03期

2 魏惠平;王昱;靳佩;王铮;;重症患者血清瓜氨酸水平与胃肠损伤的相关性研究[J];中国医学创新;2016年09期

3 席冬华;李维霞;高晶;阿塔吾拉·铁木尔;李玲;吴斌;;液相色谱-质谱法和高效液相色谱法定性定量测定籽瓜中的L-瓜氨酸[J];食品科学;2014年24期

4 许丽霞;李桂华;张涛;侯雪娇;陈文;;L-瓜氨酸泡腾片的制备及其质量检测[J];食品工业;2015年07期

5 钟兵;方勇飞;;蛋白质瓜氨酸化及其在类风湿关节炎中的意义[J];实用医院临床杂志;2015年05期

6 杨云敏;左方财;;抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体检测对早期类风湿关节炎的诊断价值探讨[J];健康之路;2017年06期

7 李爱峰;柳仁民;张永清;;高效液相色谱-蒸发光散射测定瓜蒌中L-瓜氨酸的含量[J];食品工业科技;2013年03期

8 高德玉;李晓军;武建国;;抗瓜氨酸化蛋白抗体特异性免疫复合物在类风湿关节炎中的作用[J];医学研究生学报;2013年02期

9 宗明;张慧;孙立山;李牛;虞珊珊;范列英;;瓜氨酸化波形蛋白对树突状细胞成熟及功能的影响[J];现代免疫学;2012年02期

10 方佳茂;;一株产L-瓜氨酸微生物菌株的鉴定[J];发酵科技通讯;2010年02期

相关会议论文 前10条

1 程志强;刘文革;;西瓜果实中瓜氨酸研究进展[A];纪念全国西瓜甜瓜科研与生产协作50周年暨第12次全国西瓜甜瓜学术研讨会论文摘要集[C];2009年

2 叶远馨;;环瓜氨酸抗体在类风湿关节炎诊断中的循证应用[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

3 赵义;李茹;栗占国;田昕;;瓜氨酸化作用对纤维蛋白原多肽抗原性的影响[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年

4 赵伯涛;钱骅;;两种栝楼属植物根中瓜氨酸含量测定及其提取条件优化[A];第八届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2009年

5 陈芳芳;高德玉;王凯;虞伟;严孝岭;刘阳;李晓军;;抗环瓜氨酸化肽特异性免疫复合物对关节滑膜细胞功能影响的研究[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年

6 赵义;田昕;栗占国;;抗瓜氨酸化人纤维蛋白原抗体的测定及其在类风湿关节炎的意义[A];全国自身免疫性疾病专题研讨会暨第十一次全国风湿病学学术年会论文汇编[C];2006年

7 白彩琴;张晶;夏海萍;虞伟;李晓军;武建国;;环瓜氨酸肽对胶原诱导型关节炎大鼠淋巴细胞体外增殖作用的研究[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

8 高德玉;刘阳;陈芳芳;王凯;严孝岭;虞伟;李晓军;;类风湿关节炎患者血清瓜氨酸化蛋白差异表达分析[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年

9 赵义;栗占国;田昕;;抗瓜氨酸化人纤维蛋白原抗体的测定及其在类风湿关节炎的意义[A];全国自身免疫性疾病专题研讨会暨第十一次全国风湿病学学术年会论文汇编[C];2006年

10 茅惠明;魏玮;熊伍军;陈炳官;;高效液相色谱法同时测定血浆L-精氨酸和L-瓜氨酸浓度[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年

相关重要报纸文章 前6条

1 本报特约撰稿人 徐铮奎;特种氨基酸：危机中的蓝海[N];医药经济报;2009年

2 武警广东总队医院营养科主任 曾晶;水果也能吃出性趣[N];健康时报;2010年

3 苏奎;氨基酸：小品种国际市场潜力无限[N];医药经济报;2009年

4 新讯;血清抗－VCP抗体：有助于诊断RA[N];医药经济报;2006年

5 佟世媛;最宜炎夏吃的蔬菜[N];大众科技报;2005年

6 记者　闫雪静　通讯员　田宝印 李永晖;大兴将推广5万亩新品种蔬菜[N];北京日报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 田昕;瓜氨酸化Ⅱ型胶原及其抗体在类风湿关节炎发病中作用的研究[D];吉林大学;2007年

2 陈华;Sa抗原相关蛋白质的研究[D];中国协和医科大学;2006年

3 阎海娟;中枢神经系统感染和痴呆疾病脑脊液中蛋白组学变化研究[D];天津医科大学;2011年

4 张继冉;酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[D];江南大学;2016年

5 吴殿辉;代谢工程改造黄酒酿造用酵母低产氨基甲酸乙酯的研究[D];江南大学;2016年

6 蔡彬;瓜氨酸对脓毒症早期大鼠肝损伤的保护作用及其机制研究[D];广西医科大学;2016年

7 李华涛;谷氨酰胺抗鲤鱼红细胞凋亡作用及作用机制研究[D];四川农业大学;2013年

8 郭燕燕;类胰蛋白酶是类风湿关节炎的候选自身抗原[D];第三军医大学;2014年

9 孙s，

本文编号：2687534