裂壶藻突变株高产DHA调控研究

发布时间：2020-06-06 19:02

【摘要】：我国在2010年批准了DHA藻油为新资源食品,包括以裂壶藻(Schizochytrium sp.)、寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)和吾肯氏壶藻(Ulkeniaameoboida)为来源的海洋微藻。本文以裂壶藻突变株(Schizochytrium limacinum mutant strain)为原始菌株,首先观察培养过程中裂壶藻的细胞生长发育和油脂积累过程,描述其形态学特征;然后通过添加外源化学剂研究裂壶藻突变株发酵合成脂肪酸(SFAs、PUFAs和DHA)的影响,采用基于气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分析脂肪酸的组成及含量。最后对裂壶藻突变株的酶法破壁工艺进行响应面优化,提高了油脂产量和DHA产量,并在最佳酶解条件下对裂壶藻突变株进行50 L发酵罐放大生产。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)是一种多不饱和脂肪酸,简称DHA。这种多不饱和脂肪酸对人体的大脑发育具有积极的促进作用,特别对婴幼儿的健康成长起到关键作用。然而,我们人体自身难以合成这种脂肪酸,需要通过外界摄取才能获得。DHA传统上来源于深海鱼油,不但鱼油DHA是鱼类食用了含有DHA的藻类和浮游生物而累积的,而且由于海洋污染等诸多因素导致市场供应不足,无法满足人们的需求,利用微生物发酵生产DHA成为主要的研究方向。主要研究成果如下:1.观察分析裂壶藻突变株的形态特征和油脂积累通过对裂壶藻突变株生长发育过程中形态的研究,直观地对其藻落形态、显微形态和电镜形态进行了描述。可以发现,随着培养时间的延长,藻体细胞进行分裂增殖,不断地裂殖生长,细胞数目逐渐增加、体积变大,生命代谢旺盛并且胞内有油脂的积累。微藻细胞开始分裂生殖,进入对数期生长,细胞数量大量增加,培养液中的营养物质被逐渐消耗,同时培养液由于微藻的生长变得浓稠,培养液颜色变深。培养约120h后,胞内油脂越来越多,逐渐连接成片状,此时微藻细胞的生长进入稳定期,产生大量油脂。2.化学添加剂对裂壶藻突变株发酵产DHA的影响考察外源化学添加剂对裂壶藻突变株发酵合成脂肪酸(SFAs、PUFAs和DHA)的影响。首先通过实验发现裂壶藻突变株在发酵期添加适量浓度的乙醇胺(ETA)、萘氧乙酸(BNOA)和水杨酸(SA)会提高裂壶藻突变株的DHA含量。经气质分析(GC-MS)可以发现,相对于对照组来说,饱和脂肪酸量有所下降而不饱和脂肪酸量有所提高。通过单因素实验发现在发酵期添加适量的三种化学添加剂均可以提高藻株合成DHA的能力,分别添加150mg/L的乙醇胺(ETA),10mg/L的萘氧乙酸(BNOA)和0.5mg/L的水杨酸(SA),结果显示DHA的质量分数相比于对照组分别提高了16.81%,15.52%,17.94%。然后通过正交实验,结果发现同时添加150mg/L的乙醇胺(ETA)、10mg/L萘氧乙酸(BNOA)和1mg/L水杨酸(SA)能够提高裂壶藻突变株合成DHA的能力,DHA的产量达到了6.18g/L,比对照组提高了12.77%。3.响应面法优化裂壶藻突变株的酶法破壁条件为了探索藻油提取过程中细胞破壁技术的最佳工艺条件,采用碱性蛋白酶对裂壶藻突变株进行破壁,提取胞内油脂,并研究了酶解温度、酶解时间、酶用量、pH值对油脂产量和DHA产量的影响。然后在单因素实验的基础上设计响应面实验,筛选出最佳的破壁条件,利用气相色谱-质谱联用仪(GC_MS)分析了最佳条件下藻油的脂肪酸组成及含量。结果表明,在酶解温度55℃,酶解时间9h,酶用量为生物量的3%,pH 8条件下进行摇瓶发酵培养,油脂产量和DHA产量达到最高,分别为14.52 g/L和7.12 g/L。同时进行了50 L发酵罐放大实验,油脂产量和DHA产量分别达到了26.27 g/L和12.89 g/L。
【图文】：

化学结构式

武汉轻工大学硕士学位论文]。PUFAs 按照第一个双键在甲基位置上的不同分为ω-3、ω-6 和，其中具有重要生理学功能的是ω-3 和ω-6 系脂肪酸。ω-3 系脂肪麻酸（ALA）转化而来，主要包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二HA），ω-6 系脂肪酸则是由亚油酸转化而来的，主要包括亚油酸（（GLA）和花生四烯酸（AA）[25]。PUFAs 是细胞膜细胞膜的重要人体健康非常重要，尤其是对新生儿的大脑和视力的发育是必要的系统命名为顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸，化学分子。含有 22 个碳原子，，6 个不饱和双键，属于ω-3 系多不饱和脂肪酸。构式如图 1.1 所示[26]。

显微形态,形态,活性物质,有限公司

广东润科生物科技有限公司和嘉必优生物科技有限公司等企业利用裂壶藻进行了DHA的工业化生产。裂壶藻在自然界中分布广泛，藻体形态如图1.2所示。裂壶藻细胞代谢可以积累大量的活性物质，这些活性物质对人体健康有益，包括多不饱和脂肪酸和角鲨烯等，细胞中90%以上的油脂以甘油三酯形式存在，容易被人体吸收。裂壶藻是目前工业化生产DHA比较理想的菌种，应用价值高，前景广阔。A B C图 1.2 裂壶藻的藻落形态（A）、显微形态（B）和电镜形态（C）Fig 1.2 Colony,micro-morphology and electron microscope morphology of Schizochytrium sp.
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ921

【参考文献】