高产γ-氨基丁酸短乳杆菌CD0817全基因组序列解析

发布时间：2020-06-06 19:29

【摘要】：γ-氨基丁酸是哺乳动物体内主要的抑制性神经递质,具有多种重要的生理功能,如安神、降血压和利尿等,可作为生物活性因子应用于食品与医药行业。乳酸菌通常被认为是安全的微生物,与人和动物的生命活动息息相关,在食品与医药领域占有重要地位。乳酸菌合成γ-氨基丁酸具有安全和高效的优点,已成为当前的研究热点。本实验室前期从健康成年男性肠道中分离出一株高产γ-氨基丁酸(252 g/L)的短乳杆菌CD0817,系目前已报道γ-氨基丁酸合成能力最强的乳酸菌,现保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2018462。本论文就高产γ-氨基丁酸短乳杆菌CD0817全基因组序列测定及其比较基因组学、GABA合成系统(谷氨酸脱羧酶系统)分析,以及新型基因组步移方法的建立进行了研究,主要结果如下。(1)采用第二代高通量测序技术对短乳杆菌CD0817的全基因组序列进行了测定,绘制了其完成图(染色体序列组装至0 gap)。短乳杆菌CD0817基因组由1条环状染色体和4个质粒组成,总长度为3,096,874 bp,平均GC含量为50.35%,其GenBank访问号为:CP032931.1(染色体chromosome);CP032932.1(质粒pCD0817-1);CP032933.1(质粒pCD0817-2);CP032934.1(质粒pCD0817-3);CP032935.1(质粒pCD0817-4)。短乳杆菌CD0817基因组中含有2,990个蛋白编码基因、51个tRNA基因、16个rRNA基因(4个16S-23S-5S rRNA操纵子和1个16S-23S-5S-5S rRNA操纵子)以及3个sRNA;116个长末端重复序列、68个DNA转座子、23个长散在重复序列以及7个短散在重复序列;106个串联重复序列、80个小卫星DNA以及1个微卫星DNA;8个基因岛、2个前噬菌体、6个可信的CRISPR位点以及1个细菌素合成基因簇。短乳杆菌CD0817基因组上的2,990个蛋白编码基因中,分别有1,290、1,556、1,407、2,563、1,030、2,459和79个蛋白编码基因在COG、GO、KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL和CAZy数据库上得到注释。(2)以15株已完成全基因组测序的短乳杆菌作为参考菌株,通过泛基因组分析、基因家族分析、共线性分析以及系统进化分析等手段,对短乳杆菌CD0817进行了比较基因组学研究。短乳杆菌CD0817具有很高的菌株特异性,在基因组结构、组成和功能上均与其它短乳杆菌菌株之间存在显著的差异。短乳杆菌CD0817可能与其它短乳杆菌菌株来源于共同的祖先,但在进化早期与其它短乳杆菌菌株发生了分歧,独自形成了一个不同的分枝。在选择性压力的驱动下,短乳杆菌CD0817与其它短乳杆菌菌株之间的亲缘关系逐渐变远,从而形成了其现在独有的基因组特征,成为一株特异性较高的短乳杆菌。(3)以短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶系统为对象,详细分析了该系统的基因构成和序列特征,并与其它种类乳杆菌的谷氨酸脱羧酶系统进行了比较分析。短乳杆菌CD0817基因组中只含有一个谷氨酸脱羧酶蛋白编码基因gadA,并与其上游相邻的谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白编码基因gadC形成操纵子结构(gadCA)。然而其它短乳杆菌基因组在gadCA操纵子下游约1.7 Mb处往往还存在一个单独的谷氨酸脱羧酶蛋白编码基因gadB。此外,短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶蛋白编码基因gadA明显不同于其它短乳杆菌菌株,它们的DNA和氨基酸序列之间分别只表现出79%和91%的一致性。其它种类乳杆菌基因组中则通常只含有一个谷氨酸脱羧酶蛋白编码基因,并且在亲缘关系上与gadA或gadB相接近。短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶GadA蛋白由481个氨基酸组成,共含有7,497个原子,分子式为C_(2409)H_(3708)N_(628)O_(730)S_(22),理论分子量为53.85kDa,理论等电点为4.94,预估半衰期为30小时,不稳定系数为25.72,脂肪族氨基酸指数为85.53,总平均亲水系数为-0.242,提示GadA为稳定性亲水蛋白。三级结构预测结果显示短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶GadA蛋白是由三条多肽链经α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲形成的非对称三聚体。(4)建立了一种鉴定基因组已知区域侧翼未知DNA序列的新型基因组步移方法——引物阶梯式部分重叠PCR。与传统的引物部分重叠PCR方法相比,引物阶梯式部分重叠PCR方法需要更少的引物且适合于配置预混液,具有简单性和高效性的优点。引物阶梯式部分重叠PCR作为现有基因组步移方法的一种替代方案,可应用于染色体测序工作中的gap填补,以获得完整的基因组序列。
【图文】：

核苷酸序列,测序技术

功能、进化、绘图和编辑的交叉学科。与遗传学（Genetics）有所不同，遗传学研究的是个体基因及其在进化中的作用，而基因组学旨在对基因进行整体表征和定量。基因组学的发展引发了基础科学和系统生物学的革命，促进了人们对最复杂生物系统（如大脑）的深入理解[70]。1.4.1 微生物基因组测序策略生物体的核苷酸序列中蕴藏着其遗传和生化特性信息，因此测序技术在现代生物学中是一种不可或缺的研究手段。自 1977 年 Sanger 和 Coulson 发明第一代测序技术（双脱氧链终止法）[71]以来的四十多年间，研究人员投入了大量的时间和精力来不断开发和改进测序技术，至今已发展至第三代（乃至第四代）。图 1-3（摘自网络，，原始出处不详）展示了自 1952 年 Hershey 和 Chase 证明 DNA是遗传物质[72]以来测序技术的发展历程。从第一代到第三代测序技术，测序读长由长到短，再由短到长，测序效率越来越高，测序范围和规模逐步扩大，成本逐渐降低，测序技术取得了巨大的发展。目前，测序技术已应用于临床诊断以及包括疾病风险预测、治疗鉴定和产前检测在内的医疗护理的其他方面[73]。

短乳杆菌,基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳,样品质量

碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active en注释。因组 DNA 提取0817 基因组 DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳检测结果见表 2-1。结果显示，所提取基因组较好，浓度（＞20 ng/μL）和纯度（OD260整体质量满足建库测序要求。-1 短乳杆菌 CD0817 基因组 DNA 样品质量检测ality control results of Lactobacillus brevis CD0817（ng/μL） OD260/OD280OD260/OD230151.2 1.838 1.417 样品质量
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933;TQ226.36

【相似文献】