益生菌作为药物靶向递送和控释载体的研究

发布时间：2020-06-16 02:28

【摘要】：在抗肿瘤和抗胞内菌研究中,药物存在靶向分布差、生物利用度低、血液清除快等缺陷一直没得到有效解决。许多细菌被发现具有靶向肿瘤区域的能力,利用这种能力设计具有药物靶向运输的载药体系具有广泛的应用前景。本论文利用具有肿瘤靶向能力的益生菌Escherichia coli Nissle 1917(EcN)构建了几种具有肿瘤或胞内菌靶向的药物控释载药体系。分别将抗肿瘤药物、载药杂化胶束聚合物或载药微管结合到细菌表面、将抗菌药物载入EcN制备的细菌影(BG)内腔或将肿瘤相关药物载入活菌胞内来构建不同的细菌载药剂型。制备的细菌载药剂型都具有靶向性和刺激响应性释放药物的能力。通过顺式乌头酸作为酸敏键将抗肿瘤药物阿霉素(DOX)接枝到EcN表面上构建载药细菌EcN-ca-Dox,载药量约为4.3%。细菌接枝药物后仍保持约71%的活率,并且构建过程不会减弱细菌的运动能力。体外药物释放表明EcN-ca-Dox可以在血液循环中稳定存在,而在肿瘤中快速释放DOX;活体成像检测到EcN-ca-Dox在肿瘤中的优先靶向聚集,体内分布证明EcN-ca-Dox能靶向肿瘤,且延长药物在体内的保留时间,产生比自由药物更显著的抗肿瘤效果。DOX或?-生育酚琥珀酸酯(TOS)分别与聚乙二醇结合,形成载药胶束聚合物(PM_(DOX)和PM_(TOS)),再通过四嗪/降冰片烯生物正交反应和酸敏感键连接到EcN表面上构建EcN@PM_(D/T)。在肿瘤pH的刺激下,杂化胶束聚合物从EcN@PM_(D/T)释放后自组装成杂化胶束M_(D/T)。杂化胶束在细胞内氧化还原敏感的环境中释放出药物,产生抗肿瘤效果。制备的EcN@PM_(D/T)中细菌形貌完整,细菌活率为89.2%,载药量约为5.8%,运动速度约为8.5?m/s。当PM_(DOX)和PM_(TOS)的含量为1:2时,协同效果最好,协同指数为0.29。EcN@PM_(D/T)用于肿瘤治疗能促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤增殖、有效地延长荷瘤小鼠的寿命且不存在明显的血液和肝肾毒性。通过氧化海藻酸钠和壳聚糖在聚碳酸酯膜孔中层层组装制备载DOX微管,并将其与EcN组装成载药微型火箭MT_(DOX)@EcN,载药量约为8.1%。EcN固有的运动性和肿瘤靶向能力可以促使MT_(DOX)@EcN穿透粘性基质到达肿瘤内部,并响应肿瘤区域微酸环境释放药物对抗肿瘤。EcN的推动作用促进了细胞吞噬、细胞毒性和细胞凋亡。凭借细菌的运动,细菌载药微型火箭能靶向肿瘤、促进肿瘤区域药物渗透、响应释放药物,达到抗肿瘤效果。将抗菌药物环丙沙星(CIP)载入BG内部成功构建BG@Cip,载药量为12.5%。巨噬细胞对BG具有较高的吞噬能力,是吞噬活细菌的2.5倍,使用BG载药可以有效促进药物的巨噬细胞吞噬。体外释放实验表明,在胞内微酸环境和溶菌酶存在的条件下,BG@Cip在2小时内快速释放约60%的药物。作为天然的免疫激活剂,制备的BG@Cip可提高体系中抗菌因子肿瘤坏死因子-?和白细胞介素6的含量,促进了胞内细菌的清除。通过电穿孔技术将抗肿瘤药物5-氟胞嘧啶(5FU)和巨噬细胞极化药物唑来膦酸(ZOL)装载至活细菌EcN中,并在EcN表面修饰Au纳米颗粒制备载药细菌EcN_(Z/F)@Au,载药量为17.3%(8.2%的5FU和9.1%的ZOL)。该剂型经近红外光照射30分钟,Au纳米颗粒产热能促使细菌转化成BG。细菌内部药物通过BG表面的小孔释放出来分别作用肿瘤细胞和巨噬细胞,引起较高的细胞毒性和细胞凋亡,且能促使肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化。体内实验证明EcN_(Z/F)@Au可通过光热治疗、免疫治疗和化疗的联合提升抗肿瘤效果。综上,本论文利用具有肿瘤靶向能力的EcN制备了几种不同的药物载体用于肿瘤治疗,同时利用能被巨噬细胞较好吞噬的BG装载抗菌药物治疗胞内菌。本论文制备得到的EcN或其BG载体都具有靶向性和刺激响应性释放药物的能力,为构建抗肿瘤及抗药物载体提供了新的思路。
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.1
【图文】：

西南交通大学博士研究生学位论文 第将抗菌药载入 BG 的内腔，或将肿瘤相关药物载入活细菌内。制备的载药体靶向性，并能刺激响应性释放药物。论文研究内容各部分的关系如图 1-1 所第 2 章将 DOX 接枝到 EcN 表面构建载药剂型，其载药量不理想，且细菌活率在此基础上，第 3 章使用温和的点击化学反应在细菌表面接枝载药胶束聚合的剂型载药量和细菌活率都得到了提升。为进一步增加载药量，第 4 章通过负载载药微管构建微型火箭，研究了微型火箭在肿瘤组织中的穿透能力。在载药方面，第 5 章将抗菌药物载入 BG 内部获得较高的载药量。但由于 BG 活细菌的肿瘤靶向和运动能力，第 6 章则通过电穿孔在 EcN 活细菌内部载入药物，既提高了载药量，又保留了 EcN 的靶向和运动能力。

肿瘤的化学治疗往往缺乏靶向选择性，并伴有不可忽略的副作用。胶束、脂质体和纳米颗粒等一类的纳米载体被用来增加药物的体内稳定性并延长药物体内保留时间[47]。Wilhelm 等总结近几年相关的研究结果，表明只有约 0.7%的纳米粒子成功递送到了肿瘤区域，且这个研究结果近十年没有显著提高[48]。因此有必要探索出更有效的载药体系来解决抗肿瘤治疗中的靶向性差的问题。许多细菌天生具有靶向肿瘤的能力，其中 EcN 是其中一种使用安全的益生菌[49]。利用基于细菌的载药体系来递送药物治疗肿瘤，可以达到更好的治疗效果及更小的副作用。在本章中，广谱抗肿瘤药物 DOX 分子通过酸敏感的顺式乌头酸酐键连接到 Ec表面形成 EcN-ca-Dox，该剂型可以靶向肿瘤区域并敏感释放药物作用肿瘤细胞（图 2-1通过调节载药量和细菌活率来确定 DOX 的最优接枝量。考察载药后 EcN 的运动行为体外药物释放行为。建立 4T1 小鼠乳腺癌模型，获得 EcN 载 DOX 体系的体内药物及细菌分布，并考察抗肿瘤效果。

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本文编号：2715389