高产吡咯喹啉醌扭脱甲基杆菌的定向选育与发酵优化

发布时间：2020-06-16 02:04

【摘要】：吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种醌蛋白脱氢酶的辅酶,在微生物、动物和植物体中展现出多样的生物活性,广泛应用于保健品、化妆品、医药、农业和环境等领域。由于化学合成法成本畸高,微生物发酵法生产PQQ受到广泛关注。因此,本研究以扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)I-F2为研究对象,提出一种整合流式细胞术分选和高通量筛选的策略,高效地筛选出PQQ高产突变菌株。此外,对菌株培养条件和发酵过程进行优化,确定了最佳培养基组成和发酵条件,进一步强化扭脱甲基杆菌合成PQQ的能力。本文主要研究结果具体如下:(1)以M.extorquens I-F2为出发菌株,通过整合常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变、流式细胞术分选和高通量筛选策略,提高了诱变筛选效率。通过优化样品制备处理过程和调校流式分选参数,进一步提高分选准确性。确定样品染色条件:10?g·mL~(-1)的PI与样品以1:1的比例混合后避光20°C下染色30 min。通过4轮逐级ARTP诱变处理,筛选获得了一株PQQ高产突变菌株M.extorquens 1-C6,经传代实验检测,其具有遗传稳定性。对筛选获得的菌株M.extorquens 1-C6进行摇瓶发酵,其产量为16.0 mg·L~(-1),较出发菌株提高了1.5倍。(2)在摇瓶上研究了甲醇、氮源、金属离子和生长因子对突变菌株产PQQ的影响。经单因素实验优化确定了种子培养基中金属离子和生长因子最适添加浓度为:CoCl_2·6H_2O 20 mg·L~(-1),柠檬酸铁8 mg·L~(-1),ZnSO_4·7H_2O 4 mg·L~(-1),CuSO_4·5H_2O 0.5mg·L~(-1),核黄素4μg·L~(-1),吡哆醇4μg·L~(-1),钴胺素2μg·L~(-1),对氨基苯甲酸15μg·L~(-1),泛酸钙30μg·L~(-1),硫辛酸10μg·L~(-1)。在此基础上,通过Plackett-Burman设计和响应面法优化发酵培养基,确定甲醇、硫酸铵、硫辛酸和核黄素对产PQQ有显著影响,其最适添加浓度为:甲醇30 mL·L~(-1),硫酸铵1.75 g·L~(-1),硫辛酸8μg·L~(-1),核黄素2.5μg·L~(-1)。优化后菌株M.extorquens 1-C6经摇瓶发酵产量为29.1 mg·L~(-1),较初始条件提高了81.9%。(3)在3 L发酵罐上研究了甲醇初始浓度、pH和补料方式对突变菌株产PQQ的影响。通过控制分批发酵过程中不同甲醇初始浓度,确定分批发酵最适甲醇初始浓度为40mL·L~(-1)。通过控制分批发酵过程中不同pH,确定分批发酵的pH控制策略:控制初始pH值为7.0,自然下降至6.0后恒定控制在该水平。对分批发酵过程中补料方式及补料浓度进行研究,确定了甲醇浓度自然降低至20 m L·L~(-1)时控制其浓度恒定在该水平的补料分批发酵策略。经优化后菌株M.extorquens 1-C6在3 L发酵罐上产量为208.7 mg·L~(-1),是分批发酵的5.9倍。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925
【图文】：

第一章 绪论第一章 绪论背景uinoline quinone，PQQ，也称 Methoxatin酶(ADH 和 GDH)的辅因子的水溶性醌化微生物、植物和动物组织中，在细胞内以 作为辅因子参与呼吸链电子传递，在氧化还原型是 PQQH2，在氧气存在下迅速自PQQ 有更强的抗氧化活性[2]。

图 1-2 PQQ 的骨架结构Fig. 1-2 The backbone structure of PQQ发酵法研究进展物发酵法工业化生产 PQQ 存在缺少优良菌株的问题，生物发酵法重要研究方向之一。在 1983 年，Ameyama的甲基营养菌最有利于 PQQ 生产，该菌株发酵 2 d 在培mg·L-1。随后 Mcintire 和 Weyler[42]第一次报道了甲基营

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本文编号：2715354