天然产物来源的新型除草剂抑制二羟酸脱水酶的机理研究

发布时间：2020-06-26 12:08

【摘要】：支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)是植物生长的必需氨基酸。这些氨基酸的生物合成途径由三种酶组成:乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰羟酸异构酶(KARI)和二羟酸脱水酶(DHAD)。二羟酸脱水酶DHAD在支链氨基酸BCAA生物合成途径中催化α,β-二羟酸脱水,形成亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的前体α-酮酸。DHAD蛋白参与了植物必需氨基酸的合成,因此在不同的植物物种中高度保守。而这一途径在哺乳动物中并不存在,所以可以作为良好的除草剂作用靶点。加州大学洛杉矶分校唐奕教授课题组使用以抗性基因为导向的基因组挖掘技术,发现了天然产物aspterric acid(AA)可以靶向作用于二羟酸脱水酶(DHAD),从而起到抑制植物生长的作用。他们还发现:产生菌自身除了含有DHAD外,还有一个与DHAD有70%同源性的蛋白Ast D,并证明Ast D对于AA具有抗性。本文的工作是通过X-ray单晶衍射方法解析了含有二铁二硫簇的DHAD全酶的结构,通过与袁曙光博士合作,通过计算化学的方法模拟AA抑制DHAD的机制。解释了Ast D对AA产生抗性的原因,本工作主要通过以下四步完成:1.通过铁硫簇重构,获得铁硫簇含量0.8以上的有活性中心的蛋白质。2.通过多步柱层析、无氧重构、无氧纯化等方法获得高纯度含二铁二硫簇的DHAD母体蛋白。3.通过坐滴式气相扩散的方法筛选获得1.8?左右分辨率的蛋白质晶体衍射数据,并通过使用PDB ID为5j83的蛋白质结构作为模板用分子置换的方法解析了蛋白质母体结构。4.为了探究蛋白质与抑制剂分子的结合状态,通过分子对接和结构模拟的方法探究了AA抑制DHAD的方式,以及Ast D产生抗性的机制。本论文工作首次解析了含有二铁二硫簇的DHAD全酶的晶体结构。通过与袁曙光博士合作,进行了分子对接和结构模拟,发现AA阻挡在通道当中,从而阻止了天然底物的进入,通过模拟Ast D的结构,阐明Ast D具有抗性是因为通向活性中心的通道较窄,不允许AA分子通过。我们的研究为靶向DHAD的新型除草剂研发奠定了重要基础。我们希望进一步通过对DHAD的改造,使农作物中的DHAD具有AA抗性,从而使AA及其类似物的使用得到可能。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ457
【图文】：

抗性杂草种类和数量发展趋势(Heap,2019)

新型天然产物发现模式以生物信息学为指导，通过基因组挖掘的方新型天然产物。该方法不仅可以排除已知的化合物的干扰，节约人力它还能挖掘微生物体内一些沉默基因簇，大大地拓宽了天然产物的挖掘如何从海量的微生物基因组数据库中挖掘新型活性化合物的生物合成仍然是研究人员关注且亟待解决的挑战。近年来，研究人员提出了通过抗性基因的介导从微生物基因组数据库中活性化合物的方法[15]。如图 1-3，研究表明：微生物对天然产物产生抗广泛存在的现象，在活性天然产物的选择压力下，微生物不得不通过不到抗性基因，来保护自己免受天然产物的伤害，而且这些抗性基因通常活性天然产物生物合成基因簇内或者附近。目前，一些研究人员已经依因挖掘出了一些微生物产生的新型活性天然产物，比如 BradyMoore 和者使用这种基于抗性基因的天然产物挖掘方法成功找到了一种 PKS酶的新型抑制剂[16]；Oakley 和他的合作者使用该方法成功找到了一种酶抑制剂 Fellutamide B[17]。

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本文编号：2730290