高温厌氧菌Rx1菌株的乳清发酵及其乙醇耐受性研究

发布时间：2020-06-29 17:10

【摘要】：高温厌氧菌因其底物利用范围广,具有利用多糖、寡糖和多种单糖(五碳糖,六碳糖)发酵生产乙醇的能力,是当前生物乙醇领域的研究热点。本研究以Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1及其乙酸激酶基因(ack)敲除菌株T.calidifontis Rx1△ack为研究对象,研究了其利用乳清生产乙醇的特性,并优化了最佳乙醇发酵条件。同时为了研究突变菌株△ack的乙醇耐受机理,分析了乙酸激酶基因的敲除对代谢产物的分布和碳中心代谢关键酶活性的影响。1.Rx1菌株利用乳清的乙醇代谢及其发酵条件的优化乳清作为干酪生产的副产物,大多未被合理利用。本研究利用高温厌氧菌Rx1及其突变株Rx1△ack菌株进行发酵乳清生产乙醇研究。首先通过单因素实验初步确定了影响乙醇发酵过程的主要因素有:接种量、乳糖浓度、发酵pH和发酵温度。再通过正交实验设计以发酵终点pH,底物利用率、乙醇产量和乙醇得率等为指标,最终确定了乙醇发酵的最佳条件为底物浓度为20g/L、pH值为8.5,发酵温度为60℃,接种量为8%。利用发酵罐(3L)在优化的发酵条件下,野生型和突变菌株乙醇产量分别达到3.903 g/L和4.093 g/L;得率分别为0.363 g/g和0.228 g/g;乳糖利用率分别为72%和80%。2.乙酸激酶基因敲除对Rx1菌株乙醇耐受性的影响本研究发现突变Rx1△ack菌株的乙醇耐受性比起野生型菌株提高了2%。分析不同乙醇体积分数的条件下,Rx1及Rx1△ack产物分布和碳中心代谢关键酶活性,为高温厌氧菌乙醇耐受性的生化机理研究提供了一定的理论依据。添加外源乙醇,对野生型乳酸、乙酸、乙醇的产量影响较大,不含乙醇体积分数分别为2.011g/L、1.078 g/L、1.796 g/L,添加外源乙醇其产量分别下降了27%、36%和58%。突变株由于乙酸激酶基因的敲除,添加外源乙醇对其影响不大,但乳酸产量在4%乙醇体积分数时产量最高,为2.009 g/L;乙醇产量在3%乙醇体积分数条件下最高,为2.249 g/L。相比不添加外源乙醇的条件下,野生型在3%乙醇体积分数的条件下PK酶活性最高,比起不含乙醇条件下提高了63%;在4%乙醇体积分数下LDH、ADH、ALDH酶活性最高,分别提高了150%、130%、91%。ACK酶活性没有显著变化。突变株PK、LDH、ALDH酶活性在不含外源乙醇条件下最高,分别为7.798 U、1.023 U、0.840 U;ADH酶活性在乙醇体积分数为4%时达到最大为0.581 U;ACK酶活性没有显著变化。3.Rx1菌株基因敲除遗传操作系统构建的探索目前很难找到高温条件下性能稳定的筛选标记来构建合适的打靶载体,即使是耐高温的卡那霉素,其有效抗性在48-50℃只能保持48h左右,无法有效筛选只有更高温度下才能生长的阳性重组子,有必要开发营养缺陷型标记基因的筛选标记。由于要转化多个基因,需建立一个可以重复使用的标记基因,营养缺陷型标记基因pyrF可重复使用且操作方法简单成熟。乳清酸核苷5-磷酸脱羧酶(PyrF;Orotidine5'-phosphatedecarboxylase)为乳清酸磷酸核糖基转移酶,影响尿嘧啶的合成,可用5-氟乳清酸(5-FOA)筛选。我们构建了pyrf基因的敲除质粒PMU1101,期望得到工程菌株,遗憾的是未能成功筛选到阳性转化子。我们推测主要原因是高温厌氧菌特殊的细胞膜构造和T.calidifontis Rx1感受态质量阻碍了外源基因的转化所致。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.6;TQ223.122
【图文】：

丙酮酸,途径,热力学效率,辅因子

物热力学效率是取决于各种因素,包括等辅因子的浓度：NAD+、NADP+、NADNADPH、Acetyl-CoA、HS-CoA、AMP、ADP、ATP 和 PPi 以及碳中间产物产物的浓度。反应的热力学可以通过进一步调节培养基的温度和 pH 值[28]。演示了丙酮酸异化的各种途径进行了讨论。

发酵罐,乙醇,产量

Ozmihci 等[64]采用纯培养法，以不同浓度乳清溶液培养马克思克鲁维酵母发酵乙醇，最大生产速率为 0.54 gEl-1h-1。但是利用高温厌氧菌进行乳清发酵的研究很少，大部分是利用木质纤维素的研究，其产量不高。Papanek 等[51]以预处理的柳枝稷为底物，利用热纤梭菌(Clostridium thermocellum)发酵乙醇，野生型产量为 9.1 mM，突变菌株 AG553(Δhpt ΔhydG Δldh Δpfl Δpta-ack)为 16.6 mM。本研究通过优化发酵条件，Rx1 和 Rx1 △ack 分别在 24 h 和 20 h 达到最大乙醇浓度，产量分别为 3.903 g/L 和 4.093 g/L。得率分别为 0.363 g/g 和 0.228 g/g；乳糖利用率72%和80%；野生型乳酸和乙酸产量0.268 g/L和0.182 g/L，突变菌分别为0.169g/L 和 0.098 g/L。乳酸和乙酸产量显著降低。2.4 本章小结图 2.1 Rx1 利用发酵罐生产乙醇Figure 2.1 Rx1 produce ethanol in fermenter

【参考文献】