植物乳杆菌WU14的L-AI发酵工艺研究及其分子改良

发布时间：2020-07-02 11:30

【摘要】：D-塔格糖(D-tagatose)是一种具有降低血糖、改善肠道菌群、促进血液健康等功能的新型甜味剂,广泛应用于美容、医药、食品等行业。植物乳杆菌WU14(Lactobacillus plantarum WU14,L.plantarum WU14)是一株从酸菜中分离出的乳酸菌,可产生转化D-塔格糖的L-阿拉伯糖异构酶(L-Arabinose Isomerase,L-AI)。本文在L.plantarum WU14产L-AI的发酵工艺优化基础上,建立数学模型,对D-塔格糖进行分离纯化,并利用生物信息学预测影响L-AI热稳定性的氨基酸位点,进行原核表达。研究结果如下:1、以L.plantarum WU14的生物量及L-AI酶活为指标,利用单因素与响应面实验对发酵培养基进行优化。培养基组成(g/L):葡萄糖4.35 g、L-阿拉伯糖2.71 g、酵母浸粉17.6 g、大豆蛋白胨17.6 g、无水乙酸钠10 g、MgSO_4·7H_2O 0.4 g、MnSO_4·2H_2O0.05 g、K_2HPO_4 0.4 g,培养条件:发酵初始pH值6.24、发酵温度28.6℃、接种量2%、发酵20 h,L.plantarum WU14的菌体量比优化前提高了近48%,L-AI酶活达42.23U/mL,D-塔格糖的转化率达到69.6%。2、分析L.plantarum WU14发酵过程,发现L.plantarum WU14的生物量与L-AI的形成呈部分偶联型关系。利用Logistic方程和Boltzmann模型对L.plantarum WU14生物量、L-AI酶活等实验数据进行非线性拟合,建立L.plantarum WU14生长动力学、葡萄糖消耗动力学及L-AI生成动力学模型,其拟合度分别为0.99157、0.99443、0.98461,能较好的反映L.plantarum WU14发酵过程中D-塔格糖生物转化的变化规律。3、通过离心、脱色、除蛋白、脱盐、钙树脂分离D-半乳糖、冷冻干燥等方法将D-塔格糖从发酵液中分离出来,并利用傅里叶红外光谱分析鉴定。4、反应体系中加入硼酸盐缓冲液,发现转化温度为60℃、反应pH为7.17,粗酶液的添加量与D-半乳糖体积比为5:1、硼酸盐与D-半乳糖的体积比为2:1时,转化24 h后,D-塔格糖的转化率达到68%,与未加硼酸盐转化体系相比提高12%。5、为提高L.plantarum WU14的L-AI热稳定性,对L-AI进行分子改良。经同源建模,找到3个疑似位点,将其自由组合,以E.coil BL21(DE)为表达宿主菌,构建7个突变体即G242P、G371P、G372P、G242P/G371P、G242P/G372P、G372P/G371P、G242P/G371P/G372P。进行酶学性质测定,发现突变型与野生型的最适温度及最适pH未发生变化。突变型的热稳定性都有所提高,其中三点突变(G242P/G371P/G372P)最为明显,70℃处理90 min后,仍具有53.59%的剩余酶活,野生型仅剩11.72%。说明在L-AI非催化中心区域引入脯氨酸,对提高L-AI的热稳定性有积极作用,为L-AI工业化生产和应用奠定了基础。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925

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本文编号：2738145