富硒长双歧杆菌优势菌株筛选及发酵工艺研究

发布时间：2020-07-02 19:39

【摘要】：双歧杆菌(Bifidobacterium)是1899年由法国学者Tissier从母乳喂养的婴儿粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌。它是人体内具有益生功效的优势菌群,在维持和提高免疫力、促进人体发育、延缓机体衰老、以及抗肿瘤等方面有非常重要的作用,双歧杆菌已成为人体健康的重要指标之一。硒是人体必需的微量元素,具有干预各种癌症的作用。无机硒、有机硒及元素硒是硒的几种主要存在形式,有机硒,元素硒及无机硒三者的生物利用度依次下降,而毒性依次提高。微生物转化硒产品除低毒性和生物利用度高的特点之外,还具有一系列对于人类有益的功效,因此开发富硒长双歧杆菌具有巨大的前景。本文通过富硒长双歧杆菌高通量筛选培养,利用长双歧杆菌生理代谢特点将培养液中无机硒转化为有机硒,从而获得更高生物利用度的富硒长双歧杆菌,通过对7L罐发酵条件以及冻干条件的进一步优化,得到硒蛋白含量高的富硒长双歧杆菌。首先,通过采用96孔深孔板微型化培养和酶标仪检测,建立一种快速、高效的富硒长双歧杆菌高通量筛选技术,采用初筛与复筛、富硒驯化初筛与复筛及摇瓶验证相结合的方式,筛选到一株富硒长双歧杆菌菌株XBL-20。与原始菌株相比,其摇瓶发酵活菌数提高了3倍,罐发酵活菌数约提高了4.4倍,且多次传代均能维持在较高活菌水平。其次,通过对发酵种子、发酵培养基成分、7L罐培养条件、冻干条件以及亚硒酸钠添加条件的优化,最终得到硒蛋白含量高的富硒长双歧杆菌。经过条件摸索后已经连续发酵3个批次,获得硒蛋白含量高达85%以上富硒长双歧杆菌。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q93;TQ920.6
【图文】：

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海师范大学硕士学位论文第 2 章富硒长双歧杆菌优势菌株的高通量板中，每个孔做 4 个平行。厌氧培养 18 小时后，每孔取 200μl 到 96 酶标板行 OD600检测， OD 值最大的 5 个孔接斜面进行甘油管保藏。因 OD 值反应包括活菌、死菌总共的吸光值，所以待斜面长成后，测定每个菌株的活菌菌数最高的菌株即为优势菌株，用于富硒长双岐的驯育。活菌数最高的菌株时进行甘油管保藏，3 个月要重新复苏按此流程筛选一次，以保证活菌数9CFU/ml 以上。

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2 章富硒长双歧杆菌优势菌株的高通量筛选上海师范大学硕士学位挑取点大且不红的单菌落于装有 1ml 培养基的 96 深孔板中，挑取 960 个单（10 块深孔板，96*10=960）于 5.0μg/ml 亚硒酸钠培养基的 96 深孔板中进选。厌氧培养 18 小时后，每孔取 200μl 到 96 酶标板中进行 OD600检测，最大的 3 个孔稀释 105，106涂布到 7.5μg/ml 亚硒酸钠平皿上，同时接斜面。如此反复循环，直到 20.0μg/ml 亚硒酸钠压力或者直到出现大部分红色菌止。每一个亚硒酸钠浓度压力驯化下得到的菌株都要接斜面后甘油管保存，要重新复苏按此流程筛选一次，以保证菌株的富硒能力不退化。富硒能力体：菌株发酵不变红，硒蛋白达到 85%以上。

【参考文献】