糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征、分子改造及其发酵优化

发布时间：2020-07-07 00:05

【摘要】：海藻糖是一种安全无毒的非还原性二糖,具有稳定和保护生物体或生物大分子等特殊性质,可应用于食品、化妆品、生物制剂、医药和农业等行业。海藻糖能够以淀粉为底物,在麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的催化作用下制得,成本低廉,生产潜力大。然而,在反应体系中常常会残留麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子量麦芽寡糖副产物,制约着海藻糖产量的提升。添加糖基转移酶,通过其糖基转移反应延长这些低分子量麦芽寡糖的链长,使之能够被MTSase和MTHase进一步催化利用,从而能够提高海藻糖产率。本研究选取了7种不同来源的糖基转移酶应用于海藻糖的制备,从中获得了应用效果最佳的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶(BcCGT)。考察了酶反应结束后的体系组分,发现仍剩余较多以麦芽糖为主的低分子量麦芽寡糖。为了继续提高底物利用率,进一步通过定向进化获得了对麦芽糖受体亲和性增强的突变体M234I,提升了海藻糖产率。在此基础上,将突变体M234I在枯草芽孢杆菌进行重组表达,并在3 L罐水平上实现了突变体M234I的高效制备。主要研究结果如下:(1)合成了源自Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidus和Corynebacterium glutamicum的三种4-α-糖基转移酶(4αGTase)基因并以大肠杆菌为宿主进行异源表达。考察了其与本实验室前期重组表达的源自Paenibacillus macerans、Bacillus stearothermophilus和Bacillus circulans的三种环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)和源自Thermus aquaticus的4-α-糖基转移酶对海藻糖制备的影响,并进行了各酶添加量的优化。结果表明,以浓度为150 g·L~(-1),DE值16的麦芽糊精为底物时,加入1.8 U·mL~(-1)的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶(BcCGT)时海藻糖产率最高,达到了74.1%,相比对照提高了24.0%。分析酶转化液组分发现,当在反应体系中加入糖基转移酶时,海藻糖含量越高,则葡萄糖含量越多,而麦芽糖和麦芽三糖等低分子量麦芽寡糖越少,同时发现麦芽糖在这些低分子麦芽寡糖中占比最高。(2)为进一步提高海藻糖产率,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为表达宿主,设计和构建了以提高BcCGT对麦芽糖受体亲和力为目的的高通量筛选体系。经过多批筛选后,获得了一株对麦芽糖受体亲和力提高的突变体M234I,并对野生型酶和突变体进行了分离纯化和酶学定性,发现突变体M234I以麦芽糖为受体的K_m降低至野生型的54.4%。将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,海藻糖转化率进一步提高至77.2%,分析酶反应结束后的组分,发现体系内的葡萄糖和海藻糖含量增加,麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子麦芽寡糖减少。(3)构建带有突变体M234I基因的质粒pHY300PLK-bccgtM234I的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I,并优化了重组菌的摇瓶发酵培养基,确认最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为比例为7:1的隆科特玉米浆与大豆蛋白胨。对重组菌在3 L发酵罐中进行发酵并优化了补料培养基的碳氮比,当碳氮比为3:1,最高酶活达到1423.2 U·mL~(-1)。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;TQ281
【图文】：

第一章 绪论第一章 绪论质和功能葡萄糖基以 α-1,1 糖苷键相连接而成的非子式为 C12H22O11。海藻糖的 α-1,1 键键能，使之具有了较高的稳定性。海藻糖的常，升温至 130℃时脱去结晶水形成无水结于水，且其水溶液性质稳定。海藻糖的甜为持久，可改善高砂糖含量食品的甜腻感

第一章 绪论参与了与淀粉的结合，也有研究认为该结构用。Domain D 同样是由较多 β-折叠堆叠而成不清晰，该结构域的存在可能是为了更好地定淀粉酶碳水化合物结合区域(CBM)[44]，与淀粉

5图 1-3 CGTase 催化四种反应示意图白球表示还原端的葡萄糖残基，黑球表示葡萄糖残基ig. 1-3 Schematic of the four reactions catalyzed by CGTaresents the glucose at the reducing end and the black ball reresidue转糖基反应中，歧化反应占主导地位[46]，该反至另一受体上，使得受体链变长[47]，是一种分子

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本文编号：2744337