微藻-酵母相互作用机制的多组学分析及强化单细胞油脂生产研究

发布时间：2020-07-10 05:42

【摘要】：自然环境中不同物种之间的相互作用十分普遍。利用微生物之间的相互作用可达到提高废水处理、污染物降解效率的目的。一些微藻和酵母的人工组合在同一培养体系中可表现出动态的互利关系。目前,微藻-酵母共培养的研究主要集中在工艺优化方面,两物种之间相互作用机制尚不明确。本研究以小球藻和产油酵母为研究对象,筛选出具有协同作用的最佳组合,再利用代谢组学和转录组学等分析手段阐明共培养体系中两种微生物的相互作用机制。随后以木薯渣水解液为底物对其强化单细胞油脂生产进行了系统研究。主要研究内容如下:(1)采用共培养体系对几种小球藻及产油酵母的不同组合进行了综合评价,并验证了最优组合之间协同效应关系。结果表明,以起始接种密度比为3:1共培养的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和粘红酵母(Rhodotorula glutinis)组合,相对于其他组合而言共生关系更加稳定,且生物量及油脂产率显著提高(p0.05)。与单培养相比,共培养体系葡萄糖的消耗率及不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例显著提高。在溶解氧及pH调节方面,上述微藻和酵母均表现出协同作用。(2)对筛选出的蛋白核小球藻-粘红酵母组合进行非接触式共培养,评价了两种微生物之间的相互作用对各自细胞生长及油脂积累带来的影响;基于GC/TOF-MS非靶向代谢组学研究了共培养体系中两物种胞内小分子代谢物谱的整体变化。结果表明,共培养体系中粘红酵母(R.glutinis)的细胞数量、中性脂荧光值显著高于单培养,且观察到更多的脂滴。与单培养相比,共培养中粘红酵母细胞内长链脂肪酸酸合成途径显著上调,与应激反应、防御抵抗以及调节渗透相关的肌醇、海藻糖、阿拉伯醇等代谢物丰度也显著上调。另一方面,共培养中蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)叶绿素荧光更高,与之相对应的中间产物叶绿醇的丰度也显著上调。谷胱甘肽代谢相关的代谢物显著上调,以应对环境压力。(3)采用基于GC/TOF-MS的非靶向代谢组学分析研究了蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和粘红酵母(R.glutinis)在非接触共培养中胞外代谢物谱变化规律。通过建立Biplot、SUS-plot统计模型结合单变量分析筛选出了具有重要意义的差异性代谢物(biomarkers),并对其生物学意义进行了分析和验证。结果表明甘油、丙酮酸、琥珀酸及水杨苷等四种代谢物只存在于共培养胞外环境中,而未在粘红酵母或蛋白核小球藻的单培养中检测到。十种分泌物存在于单培养环境中且共培养中该物质的丰度显著上调。包括色氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、泛酸、草酸、吲哚乙酸等。通过吲哚乙酸反加实验验证了其对粘红酵母(R.glutinis)的促生长作用。(4)基于转录组测序技术分别对蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和粘红酵母(R.glutinis)共培养前期的基因转录水平进行了全局性监测。蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)响应共培养环境,可引起色氨酸及吲哚乙酸合成、卟啉和叶绿素代谢、泛醌和其他萜烯类醌的生物合成等生物学过程中相关酶的调控基因显著上调。粘红酵母(R.glutinis)响应共培养体系,可上调细胞内参与糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环等相关酶的基因表达水平,为脂肪酸的积累提供更多的碳骨架及能量。脂肪酸合成和延伸途径中关键酶的相关基因差异性表达。硬脂酸甘油酯去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase)的相关基因表达水平剧烈上调(FC20),说明共培养条件下粘红酵母(R.glutinis)可通过合成更多不饱和脂肪酸来响应与蛋白核小球藻之间的相互作用。(5)研究了蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和粘红酵母(R.glutinis)共培养体系对非脱毒木薯渣水解物底物的微生物油脂生物转化能力。与单培养相比,共培养体系可得到更高的生物量(20.37±0.38 g L~(-1))和油脂产量(10.42±1.21 g L~(-1))。进一步采用补料分批培养,共培养体系的生物量和油脂产量分别提高到31.45±4.93 g L~(-1)和18.47±3.25 g L~(-1)。两种微生物对木薯渣水解液中的一些副产物均表现出高耐受性,且共培养体系可增强对有毒副产物的降解。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q938;TQ641
【图文】：

微藻,共培养,协同作用,体系

中微藻-酵母的协同作用。DOM：有机溶解物；S产物。gistic effects of microalga and yeast in co-culture. DOorganic matter; SM: secondary metabolite.母共培养体系的应用藻、酵母共培养的研究主要集中在各种废弃物或近年来国内外微藻-酵母共培养的研究进行了总结的选择是至关重要的。选择的微藻和酵母种类应了减少物种之间的竞争，它们的营养需求应该是，小球藻和红酵母种类的搭配得到了广泛的研究有机碳源被应用于微藻-酵母的共培养中[20]。废弃物被研究发现可作为共培养的碳源。普通小

示意图,油脂合成,微藻,途径

变可能会影响微藻中碳的分配和油脂的积累。如图etyl-CoA）是三羧酸循环（Citricate cycle，TCA）及脂胞提供能量和还原碳，丙酮酸被转化为乙酰辅酶 a，乙成合成代谢途径所需的 ATP 和碳骨架。在光照条件下光合作用，此时 TCA 循环相关基因表现出有限的调控应时期，脂肪酸的氧化最有可能为 TCA 循环提供乙酰间产物柠檬酸也是脂肪酸合成的前体物质。高活性的酸的合成提供乙酰辅酶 a。通过脂肪酸与乙酰辅酶 a 的A 内池。脂肪酸长链的形成需要从甘油酰主链上形成酰后再酯化回到甘油酰主链。这个过程需要脂肪酶和酰浆酰基辅酶 a 池为叶绿体中 EPA 的合成提供 C18。游PC 或 DGTS 分子中，然后通过肯尼迪途径（Kennedy 成中[65, 73]。

示意图,酵母油脂,途径,示意图

种产油菌株包括耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（CandTrichosporon）、红酵母属（Rhodotorula）等[74]。一些产油酵高达其干细胞重量 70% 的中性脂质。作为酵母细胞中的重要和甾醇酯在一种关键营养物质（通常是氮）缺乏的情况下大量可由亲水性底物如糖和甘油，或疏水性化合物作为底物的从 1-3 总结了酵母从底物到脂质的代谢途径[19]。在从头合成途是在乙酰辅酶 a 羧化酶（ACCase）存在的情况下，与乙酰辅启动的，从而导致丙二酰 CoA 的合成。后者由酰基载体蛋白合成酶（FAS）复合物的酰基载体蛋白中，进而使得脂肪酸的id droplet，LD）在细胞中被用来储存非极性脂质，后者包括磷脂单分子层内嵌入的蛋白质，具有各种功能，如脂类生物。酵母种类和环境条件对脂滴的大小、中性脂质组成和蛋白。

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