抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对柑橘果实酸腐病的控制效果与机制研究

发布时间：2020-07-14 03:22

【摘要】：柑橘酸腐病(Sour rot)是由白地霉(Geotrichum citri-aurantii)引起的一种常见且严重的柑橘采后侵染性病害。它在潮湿的贮藏环境下易发病,引起大量柑橘果实腐烂,从而造成严重的经济损失。化学杀菌剂是控制柑橘采后病害的主要方式,但对柑橘酸腐病的控制效果较差。且随着杀菌剂的长期使用,又逐渐出现了耐药性、高残留、环境污染及安全等问题。因此,亟需寻找和开发更加安全绿色的化学试剂和其他替代物来控制柑橘采后病害。抗菌肽(AMPs)是一种具有广谱抑菌活性的小分子多肽。已有研究报道,一些抗菌肽可以有效控制桃褐腐病、草莓灰霉病和苹果青霉病等。由于抑菌活性强,无环境污染,且不易产生耐药性等特点,抗菌肽具有作为新型的生物农药的优势及潜力,在控制采后病害方面具备良好的应用前景。本文主要通过三种昆虫来源的抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对柑橘采后酸腐病病原菌(白地霉,G.citri-aurantii)的体内和体外抑菌实验,研究其对G.citri-aurantii的抑菌效果及对柑橘果实酸腐病的控制作用。同时,通过扫描电镜和荧光染色观察、胞外电导率和胞内核酸物质泄漏测定、与基因组DNA体外结合的凝胶阻滞分析、紫外光谱及荧光光谱分析等实验,研究了mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对G.citri-aurantii细胞膜和DNA的影响。主要研究结果如下:(1)三种抗菌肽对G.citri-aurantii的体外抑菌作用抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对G.citri-aurantii具有很强的生长抑制作用和孢子致死作用,且这种作用效果随着浓度增加而增强。抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1的最小抑菌浓度(MIC)分别为8μmol L~(-1),8μmol L~(-1),2μmol L~(-1),最小杀菌浓度(MFC)分别为8μmol L~(-1),8μmol L~(-1),4μmol L~(-1)。(2)三种抗菌肽对柑橘果实酸腐病的控制作用在抗菌肽与病原菌同孔接种的情况下,mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对柑橘酸腐病害的发生均有较好的控制作用,且控制效果与处理方式和浓度有关。抗菌肽溶液与病原菌液混合0 h(或2 h)后处理的抑制效果要好于抗菌肽单独应用在病原菌接种之前(或之后)。在混合0 h(2 h)接种的处理方式下,柑橘果实贮藏15 d后,mastoparan-S,thanatin和ponericin W1处理组酸腐病的发病率与对照组相比分别降低了16.67%(21.43%),28.57%(28.57%)和22.62%(22.62%)。当抗菌肽在病原菌接种之后处理时,mastoparan-S的抑菌效果随浓度增加其提高,而thanatin和ponericin W1则在100μmol L~(-1)时就已达到其最好的抑制效果,其控制效果不再随浓度变化。在抗菌肽与病原菌异孔接种的情况下,抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1均对柑橘果实酸腐病的发生没有控制效果,说明抗菌肽处理不会诱导柑橘果实产生抗病性。(3)三种抗菌肽对G.citri-aurantii细胞膜的影响通过扫描电镜观察发现,抗菌肽mastoparan-S,thanatin,ponericin W1作用后均可引起菌丝和孢子表面形态不同程度的变化。具体表现为:菌丝塌陷扭曲折叠,孢子表面出现凹陷,其中,ponericin W1的作用效果最强。通过检测胞外电导率和胞内核酸物质泄漏,结合荧光染色可得出,抗菌肽能与G.citri-aurantii细胞膜作用,增加细胞膜通透性使其完整性受损,导致细胞内物质外泄。其中,ponericin W1的膜破坏能力最强,mastoparan-S和thanatin只有在高浓度下才能对细胞膜完整性有一定程度的破坏。此外,通过激光共聚焦显微镜观察抗菌肽的定位发现,mastoparan-S,thanatin和ponericin W1还可以穿过细胞膜进入到细胞内,说明也存在胞内作用机制。(4)三种抗菌肽对G.citri-aurantii基因组DNA的影响通过凝胶阻滞试验、紫外光谱和荧光光谱分析可知,抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1与G.citri-aurantii基因组DNA首先通过静电引力相结合,进一步可以与DNA双螺旋结构的沟槽结合,破坏或改变DNA的空间结构,以部分嵌插或嵌插的方式结合到DNA的碱基对之间,与DNA发生相互作用。其中,mastoparan-S引起DNA断裂的能力最弱。此外,抗菌肽mastoparan-S,thanatin,ponericin W1的处理还能够在一定程度上抑制G.citri-aurantii的DNA和RNA的合成。综上所述,本文所研究的抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1对G.citri-aurantii具有较强的抑制作用,同时也能有效地控制柑橘果实酸腐病的发生。这三种抗菌肽均能引起G.citri-aurantii细胞膜完整性的改变,且能进入细胞内与遗传物质发生作用,从而引起细胞死亡。本研究旨在为控制柑橘采后酸腐病病害提供新的思路和和理论参考。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ455.4;TS255.3
【图文】：

模型图,桶板,环孔,抗菌肽

第一章文献综述型”之间一种模型。抗菌肽吸附在细胞膜表面，形成 α-螺旋结构垂直插入导致脂单层连续弯曲形成环孔。抗菌肽分子与磷脂亲水性头部基团作用内侧，这也是与桶板模型的差别。研究认为，以细胞质组分为靶点的抗菌通过这种机制进入细胞膜的，当环孔瓦解时会导致肽分子被运输到细胞膜magainin 2，aurein 3.3 和 arenicin 等都是通过这种方式起作用的[66]-[68]。

抗菌肽,作用机制

第一章文献综述膜的透性增加并不一定会直接导致细胞死亡，研究表明某些抗互作用只是其作用方式的第一步，而胞内的 DNA（或 RNA）则点。Park 等人[86]研究发现，Buforin Ⅱ可以在不扰乱膜结构的情胞膜，与胞内 DNA 和 RNA 结合且不从而造成细菌死亡，随后了 Buforin 衍生肽具有 DNA 体外结合能力。Lan 等人[87]通过圆研究了 Buforin Ⅱ与磷脂膜和 DNA 结合时构象的变化，发现虽膜相互作用时具有螺旋结构，但在与 DNA 结合时采取伸展链的 DNA 结合活性不需要 α-螺旋结构。Tang 等人[88]发现一种家具有双重杀菌机制，不仅可以破坏细菌细胞膜还与细菌基因组胞功能，最终导致细胞死亡。Yonezawa 等人[89]通过凝胶阻滞试发现，tachyplesin I 可以在体外与双链 DNA 小沟结合。此外，不仅具有干扰膜的能力，还能够抑制 DNA 合成，与钙调蛋白结

曲线,生长抑制剂,抗菌肽,曲线

图 2-1 抗菌肽对 G. citri-aurantii 生长抑制剂量曲线ponse curves of growth inhibition of G. citri-aurantii b

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