芽孢杆菌角蛋白降解菌及其胞外角蛋白酶的性质、应用研究

发布时间：2020-09-28 07:24

　　微生物角蛋白酶底物广泛,既能降解可溶性蛋白,又能降解不可溶蛋白,因此在清洁剂、制革业、纺织业、饲料添加剂等行业,角蛋白酶能更好地替代传统蛋白酶;由于角蛋白酶能降解普通蛋白酶难以降解的富含角蛋白的羽毛、羊毛、蹄甲、毛发,因此被广泛应用于制革业、纺织业和角蛋白废弃物的处理。直至目前,筛选、发掘、研究有角蛋白酶生产能力的微生物菌株,以及继续开发这些菌株产的有潜在工业、商业应用潜力的角蛋白酶资源,仍是角蛋白酶研究中的重要的、待解决的问题。本实验室保存有多株角蛋白酶高产菌株,本研究选择其中有代表性的3株进行研究。1、枯草芽孢杆菌Y3-4(Bacillus sbutilis Y3-4)既能很好地降解羊毛(α-角蛋白),也能很好地降解羽毛(β-角蛋白),为更好地研究其角蛋白酶性质,我们对该菌胞外发酵液进行部分纯化,研究了粗酶液的最适酶活温度等基本酶学性质,以及还原剂、去垢剂等对该酶的影响,并对角蛋白酶在降解角蛋白废弃物等方面的应用能力进行了评价。2、枯草芽孢杆菌FJ-3-16(Bacillussubtilis FJ-3-16)产的主要角蛋白酶KerFJ比活高、抗逆性好、在角蛋白废弃物降解、洗涤剂添加剂和酶法脱毛方面具有很好的应用潜力。本论文通过单因子实验、Plackett-Burman(PB)设计和响应面法(Response surface method,RSM)优化了B.subti is FJ-3-16 的产酶条件,并建立了50 L发酵罐的产酶工艺,同时研究了该菌发酵液对难脱毛生猪(巴马香猪)猪皮及猪蹄的脱毛效果。在优化原始菌株产酶条件的基础上,本论文还对该菌产的角蛋白酶KerFJ在毕赤酵母中的异源表达进行了研究。3、蜡样芽孢杆菌Y-15(BacilluscereusY-15)是本实验室在某食品厂长期浸没羽毛的排污管淤泥中分离得到的一株菌,具有很好的羽毛降解能力。本论文利用目视观察和电镜观察了降解过程中羽毛底物结构的破坏,并利用RSM方法优化其产酶条件,为该菌株进一步的应用奠定了基础。本论文研究结果如下:1、B.subtilis Y3-4胞外部分纯化获得的角蛋白酶催化角蛋白水解的最适反应温度和pH分别为55℃和pH8.0,说明该酶属于中温碱性蛋白酶;该酶在pH 6.0～10.0范围内稳定性很好,温度超过50℃时酶活丧失很快。PMSF能够抑制其90%酶活,而专一性Zn螯合剂性邻菲罗啉(1,10-Phenanthrolinemonohydrate,O-P)对其酶活几乎无影响,这些抑制剂实验表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。金属离子螯合剂EDTA、EGTA抑制80%-90%角蛋白酶活性,金属离子实验表明Cu2+、K2+、Ca2+能提高Y3-4酶液的酶活,而Ni2+和Co2+对其有明显抑制作用。该酶耐受氧化剂H2O2、NaClO、Sodium cholate能力弱,在还原剂DTT、β-ME和DTNB存在时酶活有所提高或基本不变,说明该酶具有一定的抗逆性。该酶在大部分洗衣液中稳定性良好,并且作为洗涤剂添加剂具有很好的去污效果。此外,该酶还能够对羊皮脱毛,具有酶法脱毛的应用潜力。2、优化后的B.subtilsFJ-3-16培养基配方为:豆粉3.62%、酪素2%、玉米粉 1.41%、CaC120.16%、KH2PO4 0.1%、K2HPO40.3%,在 37℃,250r/min 条件下培养48h获得最大酶活,酶活由原有的73.82U/mL提高至166.08U/mL,提高了 1.25倍。本论文建立了 50 L发酵罐发酵产酶工艺,酶活进一步由166.08 U/mL提高到207.6 U/mL,提高了 0.44倍,同时产酶时间由48 h缩短至18 h。B.subtilisFJ-3-16粗酶液对巴马香猪小块皮张的脱毛以及对整蹄具有优异的脱毛效果:6 h完成小块皮张的脱毛,10 h可完成整蹄脱毛,20 L发酵液可一次性处理巴马香猪猪蹄/猪皮/猪头约40 kg,脱毛后的皮张品相完整、卖相佳。本论文揭示B.subtilis FJ-3-16在巴马香猪为代表的难脱毛生猪的脱毛中具有极好的应用前景,为实现角蛋白酶的工业化应用提供了研究基础。本实验室对B.subtilis FJ-3-16基因组进行测序,获得了角蛋白酶kerFJ基因序列。本研究克隆得到该基因,成功构建重组载体pPICZαA-kerFJ,并转化毕赤酵母GS115,验证得到8株重组菌株。3、B.cereusY-15可在以羽毛为唯一碳氮源的培养基中迅速生长,48h时羽毛降解率为47.5%,培养至120 h降解率达90.7%,说明该菌能高效降解羽毛废弃物。目视观察和电镜观察表明降解过程中羽毛的羽枝、羽轴和整体结构破坏严重。利用RSM优化培养基后得到配方为:豆粕0.88%、玉米粉2.23%、麸皮2%、KH2PO40.1%、CaCl2 0.22%、K2HPO40.1%,产酶提高了 20 倍。对粗酶液酶学性质的研究表明,该酶的耐热性较好,70℃条件下半衰期为20 min。该酶的pH稳定性良好,对去垢剂等有着很好耐受性,这些性质使得B.cereusY-15及其角蛋白酶在角蛋白废弃物降解方面具有发展前景。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925.2
【部分图文】：

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芽孢杆菌角蛋白降解菌及其胞外角蛋白酶的性质、应用研究

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芽孢杆菌角蛋白降解菌及其胞外角蛋白酶的性质、应用研究

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【参考文献】