一种耐高温β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中高效表达及其耐高温机理分析

发布时间：2020-10-20 15:06

　　 β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)能通过催化β-1,4-甘露糖苷键,将甘露聚糖水解为甘露糖和甘露低聚糖。作为一种重要的工业用酶制剂,β-甘露聚糖酶被广泛应用于动物饲料、食品加工、生物漂白、纺织、可再生能源等领域。由于一些应用领域在加工过程中需要进行高温处理,如饲料制粒、可再生能源生产等,这就要求所开发的β-甘露聚糖酶具有良好的耐高温性能。目前,市面上存在的β-甘露聚糖酶在耐高温性能方面往往达不到要求,因此,开发一种具有优良耐高温能力的β-甘露聚糖酶就显得非常迫切,具有良好的应用前景。在本研究中,我们从热泉中(水温高于68℃)分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的嗜热枯草芽孢杆菌(TBS2)。以TBS2为出发菌株,经过基因克隆,在毕赤酵母X33中进行表达,获得了一种重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)。采用纯化后的ReTMan26,完成了该酶的相关酶学性质检测并对其耐高温机理进行了相应分析。在此基础上,通过密码子优化,大幅提高了ReTMan26在毕赤酵母中的表达水平。此外,还确定了来源于生物柴油生产过程中产生的副产物粗甘油可以作为一种廉价碳源,用于毕赤酵母进行ReTMan26的发酵生产。主要研究结果如下:(1)从热泉中分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的细菌,通过形态观察、生理生化培养特征、16S rDNA序列比对及构建系统发育树,鉴定出该细菌为一种嗜热枯草芽孢杆菌(TBS2)。该菌可在pH 4.0-9.0、35-80℃条件下生长,最适生长pH为6.0-7.0、最适生长温度为50℃。TBS2所产的β-甘露聚糖酶(BS-Man)的最适反应pH为6.0,最适反应温度为55℃,在90℃、水溶液状态下处理10 min,剩余酶活达到63.6%。(2)通过从NCBI中查找出其它来源于枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶保守序列,设计引物,成功克隆出来源于嗜热枯草芽孢杆菌TBS2中的耐高温β-甘露聚糖酶基因TBS2-Man。TBS2-Man基因序列长957 bp,编码318个氨基酸。通过蛋白结构及基因序列分析,该β-甘露聚糖酶属于第26糖苷水解酶家族,含有3个潜在的N-糖基化位点(N8、N26与N255)及2个半胱氨酸位点(C48、C68)。在此基础上,采用克隆出的基因TBS2-Man,构建并筛选出了一株产重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)的毕赤酵母工程菌Orig-pPICZαA-X33,该菌株在摇瓶中的发酵水平为312 U×mL~(-1),在50 L罐中通过高密度液体发酵的表达水平为5435 U×m L~(-1)。(3)对重组毕赤酵母Orig-pPICZαA-X33表达的ReTMan26纯化后进行酶学性质检测,结果表明:该酶的最适pH为6.0,在pH 2.0-8.0范围内稳定;最适反应温度为60℃,有效作用温度范围为20-100℃,且在100℃、水溶液条件下处理10 min后,剩余酶活仍然可以达到58.6%;10 mmol×L~(-1)的Mg~(2+)、Mn~(2+)对ReTMan26活性具有促进作用,而Ag~+、Hg~(2+)及SDS对ReTMan26具有较强的抑制作用;ReTMan26的V_(max)为1612 U×mg~(-1)蛋白,K_m值为4.35 mg×mL~(-1)。此外,ReTMan26表现出较强的抗蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)的消化能力。以上酶学性质表明,除其它潜在工业应用外,ReTMan26适宜作为一种饲料酶进行应用。(4)为探究ReTMan26的耐高温机理,对该酶进行了氨基酸序列比对及蛋白质三维结构分析。结果表明:更短的氨基酸序列、部分氨基酸位点不同、二硫键及N-糖基化可能是造成ReTMan26具有优良耐高温性能的根本原因。为进一步确定N-糖基化及二硫键对ReTMan26的稳定性,尤其是耐高温性能的影响,分别采用天然蛋白去糖基化试剂盒及定点突变的方法,去除了ReTMan26中的N-多糖链及2个半胱氨酸位点(C48、C68)。研究发现,N-糖基化可提高ReTMan26的最适反应温度、耐热性能分别为5℃和7℃。此外,N-糖基化还可提高ReTMan26抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化性能分别为23.7%及25.6%。二硫键对ReTMan26的最适反应温度及提高抗消化酶性能没有影响,但可提高耐热性能约3℃。(5)为进一步提高ReTMan26在毕赤酵母X33中的表达水平,对来自于TBS2中的原始ReTMan26编码基因TBS2-Man(Orig)进行了密码子优化,并构建出了一株含优化基因(CoOp)的新重组毕赤酵母CoOp-p PICZαA-X33生产菌株。该菌株在高密度液体发酵中,ReTMan26的表达水平为10750 U×m L~(-1),在相同条件下,其生产性能比原重组毕赤酵母Orig-pPICZαA-X33(5412 U×mL~(-1))提高了98.6%。另外,在经过密码子优化的基因(CoOp)基础上,继续对该基因上游的信号肽(α-factor)进行了Kozak序列(GCCACCATG)改造,实验结果表明,该方法对提高ReTMan26在毕赤酵母中的表达水平没有效果,但这对今后构建毕赤酵母重组工程菌表达系统,具有一定的参考作用。(6)为降低ReTMan26的生产成本,充分利用废弃资源,采用来源于生物柴油生产的副产物粗甘油作为毕赤酵母快速生长期间的唯一碳源,结果表明:粗甘油中的皂类物质在添加浓度低于0.3%(相对于发酵培养基的质量体积比)时,不会抑制高密度液体发酵时的毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产。在此基础上,不经任何前处理的粗甘油,可替代纯甘油用于ReTMan26的发酵生产。通过采用粗甘油替代纯甘油,ReTMan26的全部发酵生产成本可降低约4.2%。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ926
【部分图文】：

[19]。β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖的示意图如图1-2所示：图1-2 β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖示意图Fig. 1-2 The schematic diagram of mannan hydrolysis by β-mannanase1.2 国内外研究、应用进展1.2.1 β-甘露聚糖酶的国内外研究、应用进展人们对β-甘露聚糖酶的研究、应用开发可以追溯到二十世纪五十年代。Courtios等人于1958年首次从紫花苜蓿(Alfalfa)中发现一种β-甘露聚糖酶[20]， Williams 和Doetsch于1960年报道从瘤胃厌氧链球菌(anaerobic rumen Streptococci)中获得一种β-甘露聚糖酶[21]， 随后，Reese和Shibata等人于1965年第一次系统性地提出了β-甘露聚糖酶的概念[22]。国内外目前对β-甘露聚糖酶的研究主要包括β-甘露聚糖酶的来源与理化性质、β-甘露聚糖酶的蛋白结构分析、β-甘露聚糖酶的发酵与分离纯化、β-甘露聚糖酶的基因克隆与表达，以及β-甘露聚糖酶的应用开发等方面。1.2.1.1 β-甘露聚糖酶的来源及理化性质β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、动物及微生物中，例如，在一些低等动物的肠道分泌液[23-25]以及一些植物的发芽种子中[26, 27]，都发现有β-甘露聚糖酶的存在。

露聚糖酶在蛋白质三维结构方面会存在一定的差异，尤其是GH5、GH26及GH113这3个家族与GH134家族相差较大。图1-3为分别属于四种不同糖苷水解酶家族的β-甘露聚糖酶蛋白三维结构模型图。图1-3 属于不同类型糖苷水解家族的典型β-甘露聚糖酶蛋白三维结构图A：属于GH5家族、来源于子囊菌(Chrysonilia Sitophila)的β-甘露聚糖酶CsMan5 (PDB ID号：4AWE)；B：属于GH26家族、来源于纤维弧菌(Cellvibrio japonicas)的β-甘露聚糖酶CjMan26C (PDBID号：4CD4)；C：属于GH113家族、来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的β-甘露聚糖酶AaManA (PDB ID号：4CD6)；D：属于GH134家族、来源于链霉菌属NRRL B-24484(Streptomyces sp. NRRL B-24484)的β-甘露聚糖酶SsGH134 (PDB ID号：5JU9)。Fig. 1-3 Three-dimensional structures of typical β-mananases belonging todifferent glycoside hydrolase familiesA: GH5 -mannanase CsMan5 from Chrysonilia Sitophila (PDB ID: 4AWE); B: GH26 -mannanaseCjMan26C from Cellvibrio japonicas (PDB ID: 4CD4); C: GH113 -mannanase AaManA fromAlicyclobacillus acidocaldarius (PDB ID: 4CD6); D: GH134 -Mannanase SsGH134 from Streptomycessp. NRRL B-24484 (PDB ID: 5JU9).虽然各种β-甘露聚糖酶在氨基酸序列上会存在一定差异，但除GH134家族外，GH5、GH26及GH113的β-甘露聚糖酶的催化域都是由8个α-螺旋及8个β-折叠交替排列形成的TIM桶状结构，其中排列在一起的8个β-折叠片段形成桶状内部凹槽结构，与之相连接的α-螺旋则组成桶的外沿。另外，在β-甘露聚糖酶的TIM桶状结构形成过程中，由处于一级氨基酸序列上不同位置的8个保守氨基酸构成该桶状的活性口袋

有助于所表达的蛋白进行检测和纯化。另外，pPICZαA质粒上含有一个强启动子pAOX1，严格受甲醇的诱导和调控。pPICZαA的结构见图1-4。图1-4 表达载体pPICZαA结构示意图Fig. 1-4 The physical map of pPICZαA vector1.2.2.1.2 启动子目前最常用的启动子为pAOX1，它可以对醇氧化酶基因AOX1进行严格调控，在甲醇存在时，可诱导该启动子下游的外源基因进行表达。至今为止，已有许多外源蛋白通过该启动子获得了表达，如来源于人类大脑组织的乙酰胆碱脂酶[144]、来源于酿酒酵母的超氧化物歧化酶(SOD)[145]以及来源于嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的耐热木聚糖酶等[146]。另外，作为不利用甲醇进行诱导的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pGAP(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)被Waterham 等于1997 年开发出来[147]。pGAP启动子可使毕赤酵母利用葡萄糖进行诱导表达，在组成型质粒pGAPZa (A,B, C)中即存在该启动子。据报道，已有部分外源蛋白通过pGAP启动子获得了表达
【参考文献】

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1 赵月菊;薛燕芬;马延和;;β-甘露聚糖酶的结构生物学研究现状和展望[J];微生物学报;2009年09期

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3 张辉;;1株青霉固体发酵产酸性β-甘露聚糖酶条件优化[J];安徽农业科学;2008年05期

4 刘朝辉;武伟娜;刘跃;齐崴;何志敏;;保护剂提高β-甘露聚糖酶热稳定性的研究[J];天津大学学报;2008年01期

5 韦赟;江正强;李里特;柴萍萍;日下部功;;枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化[J];微生物学通报;2006年01期

6 王和平,范文斌,张七斤,王龙,郭绥芝;里氏木霉RutC-30β-甘露聚糖酶的制备与纯化方法的研究[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2003年03期

7 陈秀敏,傅德贤,欧阳藩;魔芋葡甘露聚糖化学结构及改性研究进展[J];天然产物研究与开发;2002年02期

8 唐雪明,王正祥,诸葛健;具有工业应用价值的高热稳定性极端酶[J];食品与发酵工业;2001年05期

9 杨艳燕,李小明,李顺意,高尚,倪红;魔芋低聚糖对小鼠血糖含量和抗氧化能力的影响[J];中草药;2001年02期

10 吴襟,何秉旺;诺卡氏菌形放线菌β甘露聚糖酶的纯化和性质[J];微生物学报;2000年01期

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本文编号：2848833