以木糖结晶母液为原料联产木糖和乙醇工艺的建立与优化

发布时间：2020-10-23 18:30

　　 木糖结晶母液是结晶木糖生产过程中的主要副产物,主要成分为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖。进一步综合利用木糖结晶母液,对以玉米芯为主要原料生产木糖和木糖醇工业体系的健康发展,改善其经济效益并提升其环境友好,具有重要产业需求与应用价值。为此,本文探索运用新构建菌种,生物发酵转化木糖结晶母液的主要单糖(木糖除外)为乙醇并同步回收其中的木糖,可为木糖结晶母液综合加工形成新的技术方案。本文获得如下有益结果:(1)木糖不利用产乙醇大肠杆菌的单糖代谢特征解析对重组大肠杆菌B0013-2012PA运输及代谢木糖特征进行了系列评价,确认该菌株在木糖为唯一碳源的M9平板上不生长,在木糖和葡萄糖混合碳源的液体M9培养基中,木糖未被利用,细胞破碎液分析显示培养基中的木糖未运输至胞内。对重组大肠杆菌B0013-2012PA代谢利用葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖生长特征进行了系列评价。在葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖为唯一碳源的M9平板上均可生长。好氧摇瓶培养条件下,重组大肠杆菌B0013-2012PA以葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖为唯一碳源的M9液体培养基中,菌体生长速率分别为0.28 g/(L·h)、0.26 g/(L·h)、0.31g/(L·h),比生长速率分别为 0.243 h-1、0.296 h-1、0.237 h-1。对重组大肠杆菌B0013-2012PA代谢利用葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖厌氧发酵产乙醇的特征进行了系列评价。好氧培养12 h获得高活性菌体后,厌氧发酵葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖产乙醇的速率分别为0.48g/(L·h)、0.39g/(L·h)、0.31g/(L·h)。考察了高浓度木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖结晶母液和乙醇对该菌株生长抑制情况,其最小抑制浓度分别为13.7%、16.3%、11.9%、15.6%、14.1%和4.3%。结合以木糖结晶母液为原料联产木糖和乙醇的工艺特征,考察了重组大肠杆菌B0013-2012PA厌氧发酵条件下对木糖、木糖结晶母液和乙醇的耐受情况,其最高耐受浓度分别为16.7%、14.6%和6.3%。(2)乙醇发酵工艺的建立与优化。摇瓶条件下对木糖结晶母液为原料联产木糖和乙醇的工艺参数进行了系列评价,确定的最优培养基如下:M9基础培养基添加终浓度2.0 g/L的氯化铵和5.0 g/L的酵母膏,木糖结晶母液的起始添加量为发酵体积的1.5%;确定的最优工艺为好氧培养条件下,37℃,200r/min,培养12h;转入静置培养后,40℃培养至发酵结束。在最优条件下,厌氧产乙醇阶段木糖结晶母液补加量为发酵体积的10%,菌株消耗14.1 g/L葡萄糖、19.4 g/L阿拉伯糖和5.6 g/L葡萄糖,生成乙醇18.0 g/L,混合糖到乙醇转化率为45.9%,乙醇合成速率为1.19g/(L·h),较M9培养基原始发酵工艺条件下提高了3.5倍(对照的乙醇合成速率为0.34 g/(L·h));发酵液中保留的木糖含量为33.0 g/L;木糖占发酵液中总糖比例由57.0%上升至97.1%,有助于木糖作为产品的分离提取。结合摇瓶条件下确定的培养基和发酵工艺参数,在5L发酵罐体系下,采用两阶段分批补料工艺,木糖结晶母液起始添加量为发酵体积的10%,37℃好氧培养菌体约8 h,然后转入厌氧乙醇发酵阶段,分别补加三次木糖结晶母液共计900 mL,40℃发酵32 h,乙醇积累量和合成速率分别为51.0 g/L和1.59 g/(L·h);除木糖外,其他总糖到乙醇的转化率为47.2%;木糖的积累量为113 g/L,木糖占发酵液中总糖比例为98.2%。实验结果表明,木糖结晶母液为原料经重组大肠杆菌B0013-2012PA发酵可以实现木糖和乙醇的联产。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.6;TQ223.122;TQ281
【部分图文】：

（２５〇ｘ４．６ｍｍ；?５（ｉｍ）。流动相为?６０％乙腈（ｖ／ｖ），流速?１．０ｍＬ／ｍｉｎ，进样量?５｜ｉＬ，??色谱柱温度３０°Ｃ。检测器漂移管温度９０°Ｃ，空气载气流速２．２?Ｌ／ｍｉｎ，增益为１。此??方法用于分析检测混合糖液中的木糖和半乳糖，标准曲线＿如图２－２。??１４０００?１００００??１２０００?■?ｙ＝?１０，８４８ｘ４１，６１０?ｙ?＝?７，９０５?ｘ?＋９９６??，誦？?．隱?８０００?＇?＾?＝?０．９９９２??＆?８０００?■?彰?６０００?．??Ｂ?Ｚ?目?Ｚ??§?６〇〇〇?．?ｊｒ?ｍ?４〇〇〇?－??４〇〇〇?■?＾??２０００?－??２０００?■??Ｑ?？?ｘｒ．ｒ；？ｎｉ．７；ｊ？ｊｎ７Ａ７ｍ－．＇Ｕ－．Ｔｉｖ－ｆｒ；；ｘ；；．－ｉｉ＇ｒ；．－ｊｉｒ．－］ｉｒｊ｜ｒ．－ｊｊ＇．ｒ．?ｒ＾－．?ｆ＇ｒＴＴ?ｊ?Ｑ?■?１?＂＂ｎｖ；＇＂＂ｌ！＇ｒｎ?Ｉ．Ｔｒｒｒｒｍ■．…ｉｒｒ?？?＇ｉｒｉ?？?Ｔｒｙ?＇ｒ?＇ｔｒｒｖ?■?■：?－．ｒ?＾?＇?（?ｂ??０．０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２?０，０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２??木糖（ｇ／Ｌ）?半乳糖（ｇ／Ｌ）??图２－２木糖和半乳糖标准曲线??Ｆｉｇ．?２－２?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｘｙｌｏｓｅ?ａｎｄ?ｇａｌａｃｔｏｓｅ??２．２．３干燥法测定固形物含量??将玻璃平皿洗净烘干称重

葡萄糖（ｇ／Ｌ）?阿拉伯糖（ｇ／Ｌ）??图２－１葡萄糖和阿拉伯糖标准曲线??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｇｌｕｃｏｓｅ?ａｎｄ?ａｒａｂｉｎｏｓｅ??（４）?ＨＰＬＣ－蒸发光检测器条件：色谱柱Ｗａｔｅｒｓ?Ｐｒｅｖａｉｌ?Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ?ＥＳ?５ｕ??（２５〇ｘ４．６ｍｍ；?５（ｉｍ）。流动相为?６０％乙腈（ｖ／ｖ），流速?１．０ｍＬ／ｍｉｎ，进样量?５｜ｉＬ，??色谱柱温度３０°Ｃ。检测器漂移管温度９０°Ｃ，空气载气流速２．２?Ｌ／ｍｉｎ，增益为１。此??方法用于分析检测混合糖液中的木糖和半乳糖，标准曲线＿如图２－２。??１４０００?１００００??１２０００?■?ｙ＝?１０，８４８ｘ４１，６１０?ｙ?＝?７，９０５?ｘ?＋９９６??，誦？?．隱?８０００?＇?＾?＝?０．９９９２??＆?８０００?■?彰?６０００?．??Ｂ?Ｚ?目?Ｚ??§?６〇〇〇?．?ｊｒ?ｍ?４〇〇〇?－??４〇〇〇?■?＾??２０００?－??２０００?■??Ｑ?？?ｘｒ．ｒ；？ｎｉ．７；ｊ？ｊｎ７Ａ７ｍ－．＇Ｕ－．Ｔｉｖ－ｆｒ；；ｘ；；．－ｉｉ＇ｒ；．－ｊｉｒ．－］ｉｒｊ｜ｒ．－ｊｊ＇．ｒ．?ｒ＾－．?ｆ＇ｒＴＴ?ｊ?Ｑ?■?１?＂＂ｎｖ；＇＂＂ｌ！＇ｒｎ?Ｉ．Ｔｒｒｒｒｍ■．…ｉｒｒ?？?＇ｉｒｉ?？?Ｔｒｙ?＇ｒ?＇ｔｒｒｖ?■?■：?－．ｒ?＾?＇?（?ｂ??０．０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２?０

（２）木糖在细胞内外的积累：将ＬＢ种子接种到以．１．５?ｇ／Ｌ木糖和３．５?ｇ／Ｌ葡萄糖??为混合碳源，好氧培养菌体１２?ｈ，收集菌体并超声破碎细胞，利用ＨＰＬＣ检测细胞内??外的木糖含量。结果如图３－２，菌株１０３１利用部分木糖，细胞外木糖含量为０．４９±０．０４５??ｇ／Ｌ，细胞内木糖含量为０．１１±０．０１２?ｇ／Ｌ；菌株２０１０不利用木糖，细胞内木糖含量为??０．ｌ３±０．０１１ｇ／Ｌ，细胞外木糖含量为丨．３９±０．０５３?ｇ／Ｌ；菌株２０１２不利用木糖，细胞内的??木糖的含量为０．０４±０．０ｌ０ｇ／Ｌ，细胞外的木糖的含量为１．５６±０．１０３ｇ／Ｌ。由于￡．ｃｏ／／??Ｂ００１３－２０１２ＰＡ细胞质膜上的木糖转运蛋白基因＃／五被敲除，木糖不能被运输到细胞??内。所以，虽然菌株２０１０和２０１２都不能利用木糖，但是菌株２０１２的细胞内不会积??累木糖。在工业生产中，微生物细胞成为发酵液的主要组成成分，木糖在细胞内外的??分布情况会影响木糖的收得率。如果在细胞内不积累木糖，则为后提取工艺提供了极??大便利。??２．０?
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本文编号：2853390