环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC 2.4.1.19)可通过环化反应转化淀粉或其衍生物合成环糊精。常见的环糊精为α-、β-和γ-环糊精,分别由6、7或8个葡萄糖构成。环糊精可和众多客体分子形成包合物,改善其理化性质。目前,常选用单一类型环糊精与客体分子包合,而野生型CGT酶转化淀粉的产物多为三类环糊精混合物,需经过复杂的分离纯化来获取单一环糊精,因此限制了其规模化生产与应用。本论文针对CGT酶制备环糊精产物特异性差这一问题,对CGT酶底物结合亚位点进行分子改造,优化了α-环糊精和γ-环糊精的制备工艺以及γ-CGT酶发酵工艺。主要研究结果如下:(1)-7亚位点对产物特异性的影响。通过序列及结构分析,鉴定了Peanibacillus maceransα-CGT酶的-7亚位点,设计并获得多个突变体,其中单突变D147A、R146P、D147P和双突变R146A/D147P、R146P/D147A、R146P/D147P的β-环糊精的合成比活力显著降低,产物α-环糊精比率由野生型的63.2%分别提升至68.8%、71.4%、73.0%、75.1%、76.1%和76.8%。结合结构分析,提出在-7亚位点处引入脯氨酸残基封闭氨基酸骨架-NH-与糖单元氢键以降低β-环糊精形成,进而提高α-环糊精比率的设计改造策略,并在Bacillus stearothermophilus NO2来源的α/β-CGT酶中得到验证,α/β-CGT酶突变体E142P和T143P产物α-环糊精比率由野生型的39.5%上升到53.0%和48.7%。(2)-3亚位点对CGT酶产物特异性的影响。通过序列及结构分析,设计并获得47位和94位的多个突变体(以B.circulans 251来源β-CGT编号为依据)。在47位点处,P.maceransα-CGT酶突变体K47T的α-环糊精合成比活力显著降低,γ-环糊精合成比活力显著上升,产物α-环糊精的比率由55.5%降为39.0%,γ-环糊精的比率由12.9%提升至17.0%;B.circulans 251β-CGT酶突变体R47T的β-环糊精合成比活力显著降低,γ-环糊精合成比活力显著上升,产物γ-环糊精的比率由16.2%提升至19.3%。上述结果表明,47位长侧链氨基酸R或K侧链的移除降低了CGT酶环化活性,但有利于γ-环糊精的生成。在94位点处,B.clarkiiγ-CGT酶突变体F91N、F91L的三种环糊精合成比活力显著上升,产物γ-环糊精的比率由野生型的77.1%降为61.4%和62.9%;P.maceransα-CGT酶突变体N94W和B.circulans 251β-CGT酶突变体N94W环化活性显著降低,产物γ-环糊精比率分别由12.9%和16.2%提升至23.4%和25.7%,结果表明,当94位为小侧链氨基酸时有利于CGT酶的环化反应活性,当94位为大侧链氨基酸时,不利于CGT酶的环化反应活性,但有利于产物γ-环糊精的生成。(3)中心亚位点、-7亚位点以及与-3亚位点的组合突变对CGT酶产物特异性的影响。通过序列及结构分析,设计并获得多个突变体。在中心亚位点处,P.maceransα-CGT酶突变体Y195W和B.circulans 251β-CGT酶突变体Y195W环化活性显著降低,产物中γ-环糊精比率由12.9%和16.2%分别上升至17.0%和19.3%。B.clarkiaγ-CGT酶突变体Y186W的产物中γ-环糊精比率由77.6%上升至94.6%。在-7亚位点,P.maceransα-CGT酶和B.circulans 251β-CGT酶突变体Δ(145-151)D产物γ-环糊精比率由12.9%和16.2%分别上升至21.4%和33.7%。采用-7亚位点疏通长链结合空间,-3亚位点限制弯曲构象及中心位点增大被包埋侧链的亚位点改造策略,设计的组合突变体N94W/Δ(145-151)D/Y195W产γ-环糊精比率由12.9%和16.2%分别上升至40.3%和45.1%。(4)复合剂对CGT酶及其突变体制备环糊精的影响。研究不同种类的醇类和环状复合剂对CGT酶及其突变体制备环糊精的影响。结果表明,在α-环糊精的制备中,当采用低沸点的正辛醇为复合剂时,P.maceransα-CGT酶和突变体R146R/D147A环糊精总转化率分别为56.6%和53.5%,其中α-环糊精比率分别为73.8%和89.7%,表明选用低沸点的正辛醇为复合剂制备α-环糊精时突变体R146R/D147A更具备优势。在γ-环糊精的制备中,以环十二酮为复合剂时,采用B.clarkiaγ-CGT酶和突变体Y186W环糊精总转化率分别为74.4%和72.8%,其中γ-环糊精比率分别为88.3%和96.6%,表明突变体Y186W制备γ-环糊精优于野生型酶。(5)小分子伴侣对大肠杆菌生产γ-CGT酶的影响。通过筛选小分子伴侣及发酵条件优化,发现培养基中添加环糊精可有效降低γ-CGT酶包涵体形成、提高可溶表达。摇瓶发酵中,当添加β-环糊精浓度为7.5 mM时,γ-CGT酶总酶活最高为5.51 U·mL~(-1),是对照组的1.95倍。在3L发酵罐中,添加7.5 mMβ-环糊精,乳糖0.3 g·L~(-1)·h~(-1),γ-CGT酶总酶活可达到50.29 U·mL~(-1),是对照组1.71倍。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925
【部分图文】：
图 1-1 -、β-和 γ-环糊精的化学结构。Fig. 1-1 Chemical construction of -, β-, γ-cyclodextrin.环糊精具有中空圆筒形的立体结构，略呈锥形（图 1-2）。在环糊精分子中，所有葡糖均呈现椅式构象。葡萄糖 C2 位和 C3 位的仲羟基位于锥形圆筒的宽外侧，葡萄糖
图 1-2 环糊精与客体分子的包埋方式[4]。Fig. 1-2 Complexes of cyclodextrin (host) and substrate(guest)[4].糊精的理化生性质糊精的物理性质
图 1-3 环糊精生产工艺。A，控制过程；B，非控制过程。Fig. 1-3 Production process of cyclodextrin.A, Solvent process; B, Non-solvent process.
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 王霞;刘晓丹;于晓明;;凤尾鸡冠花耐盐突变体的RAPD鉴定[J];吉林农业;2016年23期
2 王振业;;水稻类病斑突变体研究进展[J];生物技术世界;2015年06期
3 全瑞兰;王青林;马汉云;扶定;霍二伟;沈光辉;郭桂英;;水稻白化转绿突变体研究进展[J];安徽农学通报;2015年12期
4 顾玉成,吴金平;利用离体培养技术筛选抗病突变体的研究进展[J];湖北农业科学;2004年02期
5 舒翠玲,郭燕翔,胡美茹,栾尧,沈倍奋;人CD28分子突变体的构建和表达[J];细胞与分子免疫学杂志;1999年02期
6 程渊,沈子威,赵南明,孙彤,王敖金,胡坤生;蜂毒突变体对紫膜质子泵功能的影响[J];生物物理学报;1997年01期
7 刘士辉,黄培堂,黄翠芬;组织型纤溶酶原激活剂突变体的构建、表达及特性分析[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1995年04期
8 周松茂,李代玺,徐光华;水稻辐射突变体遗传变异的初步研究[J];遗传;1985年02期
9 丁小令;矮杆、优质的水稻突变体[J];贵州农业科学;1986年01期
10 K.S.McKenzie;金卫;;一个水稻长粒型品种的半矮秆突变体[J];核农学通报;1987年02期
相关博士学位论文 前10条
1 柴丽红;PGRN突变体功能研究及PGRN相互作用分子的筛选与鉴定[D];陕西师范大学;2011年
2 王蕾;环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性分子改造及发酵制备研究[D];江南大学;2018年
3 王日欣;家蚕体形突变体樽蚕（tub）的定位克隆及分子机制探析[D];西南大学;2018年
4 王闵霞;水稻分蘖调控基因OsIAA16的功能研究和d14突变体遗传修饰因子的创制[D];中国农业科学院;2016年
5 张婷;LATERAL FLORET 1调控水稻“三花小穗”发育的分子机制研究[D];西南大学;2018年
6 李然红;白桦早衰突变体的鉴定与研究[D];东北林业大学;2018年
7 王平阳;家蚕类鹑斑突变体q-l突变基因的功能研究[D];江苏科技大学;2018年
8 刘振伟;水稻植株形态突变体（pad）的基因克隆与功能研究[D];武汉大学;2014年
9 刘凯;水稻硼缺陷突变体的基因克隆及其功能分析[D];南京农业大学;2014年
10 王超;拟南芥FIP1基因调控硝态氮信号的分子机理[D];山东农业大学;2016年
相关硕士学位论文 前10条
1 王梦迪;抗抑制活性木聚糖酶突变体的研究[D];河南农业大学;2015年
2 田荣;BAK1特异突变体互作组分的筛选[D];西北农林科技大学;2014年
3 程彬;Halomonas sp. Y2中NhaD型Na~+/H~+逆向转运蛋白及其突变体功能研究[D];山东大学;2016年
4 操詹魁;新城疫病毒HN糖蛋白头颈部相互作用区基因突变分析[D];山东大学;2018年
5 于小霞;拟南芥亲免蛋白CYP26-2功能初探及一个糖敏感型突变体基因定位与表型鉴定[D];西北大学;2018年
6 黄朝琨;铝不敏感型拟南芥突变体的特征分析及突变基因筛选[D];广西大学;2018年
7 姚锴琳;分子改造提升嗜酸热硫化叶菌MTSase酶活力研究[D];江南大学;2018年
8 袁米军;尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的敲除及突变体遗传特性的研究[D];内蒙古工业大学;2017年
9 何贤;斑马鱼前肾突变体的遗传筛选及致变基因的克隆[D];西南大学;2018年
10 陈新;脱氮硫杆菌ATCC25259 SQR蛋白及突变体的结构、相互作用分析及酶活性研究[D];华南理工大学;2017年
本文编号：
2876261
