红球菌低分子量型腈水合酶激活蛋白的结构与功能解析
发布时间：2021-03-29 06:10
腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase,EC 4.2.1.84）是一种能够催化腈类化合物通过水合反应生成酰胺类化合物的金属酶,由α和β两种亚基构成。按照活性中心结合的金属离子不同,可将NHase分为铁型腈水合酶（Fe-NHase）和钴型腈水合酶（Co-NHase）。NHase的生物合成需要一种激活蛋白的参与,其能辅助NHase摄取金属离子及完成翻译后修饰。根据前期研究,玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1中低分子量型腈水合酶（L-NHase）的成熟过程遵循“亚基自身交换”机制,即:不含钴离子的脱辅基酶apo-α2β2和含钴离子的蛋白复合物holo-αe2之间发生α亚基的交换,从而形成具有活性的全酶holo-α2β2。参与“亚基自身交换”过程的激活蛋白e与其它Co-NHase激活蛋白在Co-NHase的翻译后成熟过程中发挥了关键作用,但相关的研究较少,其作用机制尚未明确。本研究通过分子生物学、结构生物学和生物信息学等技术,解析激活...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
腈类物质代谢过程中的NHase[27]
江南大学硕士学位论文4αCys115与βArg56之间的氢键对提供配体的2个半胱氨酸残基起到稳定作用，其中参与氢键形成的2个精氨酸残基在所有NHase中保守。图1-21AHJ的晶体结构[42]β亚基和α亚基分别以黄色和蓝色表示，红色小球代表铁离子Figure1-2Crystalstructureof1AHJShigehiroNagashima等在研究Rhodococcussp.N-771的Fe-NHase结构（PDBID：2AHJ）时，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry，FT-ICRMS）分析，发现活性中心保守基序中的第2个和第3个半胱氨酸残基，经过翻译后修饰分别被氧化为半胱氨酸亚磺酸（Cys-SO2H）和半胱氨酸次磺酸（Cys-SOH）；并且发现失活状态下Fe-NHase中的铁离子与1个一氧化氮分子的氮原子配位（光照后一氧化氮分子被水分子取代从而激活Fe-NHase[43]），来自于αCys112-SO2H、αSer113和αCys114-SOH的3个氧原子构成爪状结构（clawsetting），对活性中心结构起到稳定作用[44]。随后，Co-NHase的晶体结构也陆续得到解析，其来源有嗜热假诺卡氏菌PseudonocardiathermophilaJCM3095（PDBID：1IRE）[45]、史氏芽胞杆菌BacillussmithiiSC-J05-1（PDBID：1V29）[46]和恶臭假单胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668（PDBID：3QXE）[47]等。Co-NHase与Fe-NHase在α亚基和β亚基的一级序列上均具有保守区域，两者的三级结构同样非常相似，但一些参与底物识别与结合的氨基酸残基呈现差异，可能导致两者具有不同的底物偏好性[45]。Co-NHase的活性中心结构（图1-3）也与Fe-NHase高度相似，与钴离子配位的配体构成八面体结构，并且存在2个翻译后修饰的半胱氨酸残基和爪状结构，不同之处是钴离子与1个水分子的氧原子配位，而不能与一氧化氮分子配位，这也是Co-NHase不具有光反应性?
第一章绪论5图1-3Co-NHase的活性中心结构[50]粉色小球代表钴离子，黑色小球代表碳原子，红色小球代表氧原子，黄色小球代表硫原子，蓝色小球代表氮原子，配体与钴离子的配位作用以黑色点线表示，氧化修饰的半胱氨酸残基与2个精氨酸残基形成的盐桥以红色点线表示Figure1-3StructureofCo-NHaseactivecenter1.2.4腈水合酶激活蛋白在NHase的研究过程中，研究者们发现，不论对于Fe-NHase还是Co-NHase，仅仅有β亚基、α亚基和金属离子的参与，不能形成具有正常活性的成熟酶[50,51]。生物体内与NHase相关的基因簇中，往往存在多个行使调控功能的基因，其中在编码β亚基和α亚基的结构基因下游存在一种编码NHase激活蛋白的基因，该类蛋白能够辅助NHase的成熟[20,52-54]。周哲敏等在研究来源于R.rhodochrousJ1的低分子量型腈水合酶（L-NHase）时，发现L-NHase摄取钴离子和活性表达依赖于一种激活蛋白e的协助，并基于此提出了一种全新的金属酶生物合成机制——亚基自身交换机制[50,55]（“self-subunitswapping”mechanism，图1-4）。该机制认为，β亚基和不含钴离子、半胱氨酸残基未被氧化修饰的α亚基结合形成脱辅基酶apo-α2β2；同时激活蛋白e辅助α亚基摄取钴离子，完成半胱氨酸残基的氧化修饰，形成蛋白复合物holo-αe2；在apo-α2β2中β亚基的2个保守精氨酸残基与holo-αe2中α亚基的2个氧化修饰的半胱氨酸残基之间的静电引力驱动下，两者的α亚基发生互换，形成全酶holo-α2β2和蛋白复合物apo-αe2；apo-αe2可继续摄取钴离子，进行下一轮亚基自身交换。激活蛋白e在该过程中发挥了亚基自身交换伴侣蛋白的功能。这种机制在Co-NHase中具有一定的普遍性，刘义等证明了P.putidaNRRL-18668来源的Co-NHase同样遵循亚基自身交换机制[56
【参考文献】：
期刊论文
[1]同步辐射光源及其特点[J]. 毕拉力·木乎提江,阿力甫江·扎依提. 新疆师范大学学报(自然科学版). 2015(04)
[2]Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略[J]. 余越春,崔文璟,刘义,周哲敏. 工业微生物. 2014(02)
[3]蛋白质晶体的物理性质及其鉴别方法研究进展[J]. 解旭卓,曹慧玲,鹿芹芹,陈瑞卿,郭云珠,周伯儒,尹大川. 生物技术通讯. 2013(01)
[4]蛋白质结晶方法的研究进展[J]. 刘四化,王倩倩,肖良,张黎明. 中国生化药物杂志. 2011(05)
[5]烟酸和烟酰胺的合成和应用[J]. 徐兆瑜. 精细化工原料及中间体. 2003(09)
[6]丙烯酰胺及其聚合物的生产技术及应用[J]. 吴晓云,顾文杰. 现代化工. 2002(S1)
[7]金属离子对酶功能所起的作用[J]. 王健. 宜宾师专学报. 1993(02)
本文编号：3107055
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
腈类物质代谢过程中的NHase[27]
江南大学硕士学位论文4αCys115与βArg56之间的氢键对提供配体的2个半胱氨酸残基起到稳定作用，其中参与氢键形成的2个精氨酸残基在所有NHase中保守。图1-21AHJ的晶体结构[42]β亚基和α亚基分别以黄色和蓝色表示，红色小球代表铁离子Figure1-2Crystalstructureof1AHJShigehiroNagashima等在研究Rhodococcussp.N-771的Fe-NHase结构（PDBID：2AHJ）时，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry，FT-ICRMS）分析，发现活性中心保守基序中的第2个和第3个半胱氨酸残基，经过翻译后修饰分别被氧化为半胱氨酸亚磺酸（Cys-SO2H）和半胱氨酸次磺酸（Cys-SOH）；并且发现失活状态下Fe-NHase中的铁离子与1个一氧化氮分子的氮原子配位（光照后一氧化氮分子被水分子取代从而激活Fe-NHase[43]），来自于αCys112-SO2H、αSer113和αCys114-SOH的3个氧原子构成爪状结构（clawsetting），对活性中心结构起到稳定作用[44]。随后，Co-NHase的晶体结构也陆续得到解析，其来源有嗜热假诺卡氏菌PseudonocardiathermophilaJCM3095（PDBID：1IRE）[45]、史氏芽胞杆菌BacillussmithiiSC-J05-1（PDBID：1V29）[46]和恶臭假单胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668（PDBID：3QXE）[47]等。Co-NHase与Fe-NHase在α亚基和β亚基的一级序列上均具有保守区域，两者的三级结构同样非常相似，但一些参与底物识别与结合的氨基酸残基呈现差异，可能导致两者具有不同的底物偏好性[45]。Co-NHase的活性中心结构（图1-3）也与Fe-NHase高度相似，与钴离子配位的配体构成八面体结构，并且存在2个翻译后修饰的半胱氨酸残基和爪状结构，不同之处是钴离子与1个水分子的氧原子配位，而不能与一氧化氮分子配位，这也是Co-NHase不具有光反应性?
第一章绪论5图1-3Co-NHase的活性中心结构[50]粉色小球代表钴离子，黑色小球代表碳原子，红色小球代表氧原子，黄色小球代表硫原子，蓝色小球代表氮原子，配体与钴离子的配位作用以黑色点线表示，氧化修饰的半胱氨酸残基与2个精氨酸残基形成的盐桥以红色点线表示Figure1-3StructureofCo-NHaseactivecenter1.2.4腈水合酶激活蛋白在NHase的研究过程中，研究者们发现，不论对于Fe-NHase还是Co-NHase，仅仅有β亚基、α亚基和金属离子的参与，不能形成具有正常活性的成熟酶[50,51]。生物体内与NHase相关的基因簇中，往往存在多个行使调控功能的基因，其中在编码β亚基和α亚基的结构基因下游存在一种编码NHase激活蛋白的基因，该类蛋白能够辅助NHase的成熟[20,52-54]。周哲敏等在研究来源于R.rhodochrousJ1的低分子量型腈水合酶（L-NHase）时，发现L-NHase摄取钴离子和活性表达依赖于一种激活蛋白e的协助，并基于此提出了一种全新的金属酶生物合成机制——亚基自身交换机制[50,55]（“self-subunitswapping”mechanism，图1-4）。该机制认为，β亚基和不含钴离子、半胱氨酸残基未被氧化修饰的α亚基结合形成脱辅基酶apo-α2β2；同时激活蛋白e辅助α亚基摄取钴离子，完成半胱氨酸残基的氧化修饰，形成蛋白复合物holo-αe2；在apo-α2β2中β亚基的2个保守精氨酸残基与holo-αe2中α亚基的2个氧化修饰的半胱氨酸残基之间的静电引力驱动下，两者的α亚基发生互换，形成全酶holo-α2β2和蛋白复合物apo-αe2；apo-αe2可继续摄取钴离子，进行下一轮亚基自身交换。激活蛋白e在该过程中发挥了亚基自身交换伴侣蛋白的功能。这种机制在Co-NHase中具有一定的普遍性，刘义等证明了P.putidaNRRL-18668来源的Co-NHase同样遵循亚基自身交换机制[56
【参考文献】：
期刊论文
[1]同步辐射光源及其特点[J]. 毕拉力·木乎提江,阿力甫江·扎依提. 新疆师范大学学报(自然科学版). 2015(04)
[2]Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略[J]. 余越春,崔文璟,刘义,周哲敏. 工业微生物. 2014(02)
[3]蛋白质晶体的物理性质及其鉴别方法研究进展[J]. 解旭卓,曹慧玲,鹿芹芹,陈瑞卿,郭云珠,周伯儒,尹大川. 生物技术通讯. 2013(01)
[4]蛋白质结晶方法的研究进展[J]. 刘四化,王倩倩,肖良,张黎明. 中国生化药物杂志. 2011(05)
[5]烟酸和烟酰胺的合成和应用[J]. 徐兆瑜. 精细化工原料及中间体. 2003(09)
[6]丙烯酰胺及其聚合物的生产技术及应用[J]. 吴晓云,顾文杰. 现代化工. 2002(S1)
[7]金属离子对酶功能所起的作用[J]. 王健. 宜宾师专学报. 1993(02)
本文编号：3107055
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