Humicola insolens角质酶在Escherichia coli中的重组表达、发酵优化及其应用

发布时间：2021-03-30 03:00

　　角质酶是一种多功能水解酶,能够水解短链或长链脂肪酸酯和甘油三酯,也可用于降解植物的多聚体角质,是棉织物生物精炼工业中的重要酶类。本研究首先将特异腐质霉来源（Humicola insolens,H.insolens）的角质酶基因（hic）在大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）中进行重组表达,研究其酶学性质;再通过3-L罐水平上的发酵优化,进一步提高该重组酶的表达水平;最后,对重组酶在棉织物生物精炼中的应用进行条件优化。主要研究结果如下:1.实现了H.insolens来源的角质酶基因在大肠杆菌中的克隆表达。构建重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）//hic,将重组菌在摇瓶中培养24h,发酵上清液中的角质酶活性为170 U·mL-1。通过硫酸铵沉淀、阳离子交换柱对重组角质酶进行纯化,考察其酶学性质。结果表明,重组酶的最适反应温度为80℃、最适pH为8.5;在80℃、pH 8.5条件下,重组酶半衰期为11 min;在60℃、pH 8.5条件下,重组酶的半衰期为14 h;在4℃、pH 5.0-10.0的条件下,均可保持长时间的稳定;比活力1047 U... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

植物角质的化学结构

图 1-2 植物角质的化学结构Fig. 1-2 Chemical structure of Plant Cuticle1.2.3 蜡质与角质层水分渗透结构模型蜡质是角质层的化学组成成分之一，成熟棉纤维中的蜡质组成成分及其熔点如表1-2 所示。蜡质在角质层中以两种不同的沉积方式存在：沉积于角质层外表面或嵌入角质层[53]。虽然蜡质在角质膜中所占的比例小于角质，但却是对角质层渗透性起决定性作。Schreiber等[54]出并验证了三种角质层水分渗透结构模型的存在，模型如图 1-3所示。沉积在角质层外表面的蜡质会形成疏水的限制性屏障，将水分子同纤维隔离开来。仅有少量水分子会通过表面上留有的极性聚合物通道进入纤维内层。有研究报道称，将植物角质层脱去蜡质后, 角质层的水分渗透性可 高142-2031倍[55]。由于蜡质在纤维结构中的位置和其疏水特性，去除蜡质对 高棉织物的润湿性有重要意义。在生物精炼中主要通过沸水预处理的方式，融化去除纤维表面蜡质，暴露内层角质，加速酶反应。

3.1 Humicola insolens 角质酶在 E. coli 中的重组表达和酶学性质研究3.1.1 重组质粒 pET-20b(+)/hic 的构建参照2.2.2的方法，构建重组质粒pET-20b(+)/hic，构建流程如图3-1所示。对构建成功的质粒，使用内切酶Nco I和Hind III双酶切验证，酶切验证电泳图如图3-2所示。在600 bp左右处出现了H. insolens角质酶基因的特征条带，4000 bp左右处出现了pET-20b(+)载体的特征条带，重组质粒pET-20b(+)/hic构建成功。图3-1 重组质粒 pET-20b(+) / hic 的构建流程Fig. 3-1 The construction process of recombinant plasimd pET-20b(+)/hic


本文编号：3108725