来源于甲醇芽孢杆菌的普鲁兰酶的重组表达、酶学性质及分子改造研究
发布时间：2021-04-13 04:45
普鲁兰酶作为一种淀粉脱支酶可以高效催化普鲁兰糖、支链淀粉等底物中α-1,6-糖苷键的水解,在食品加工、生物能源、制药及化工等领域有广泛的应用。目前,尽管有很多研究集中于挖掘新的催化性能良好的普鲁兰酶,或对现有的普鲁兰酶进行分子改造以适应淀粉糖化工艺的条件。但是,理想的符合工业生产特性的普鲁兰酶,特别是可以用于淀粉冷水解工艺的普鲁兰酶非常少。随着淀粉水解技术的不断革新,淀粉深加工领域的不断拓展,筛选具备优良催化性能的普鲁兰酶对于优化生产工艺,降低生产成本,加强淀粉生物质资源的开发利用具有重要意义。本研究分析了嗜温菌Bacillus methanolicus PB1的基因组信息,找到一段候选普鲁兰酶基因（pul PB1）,在大肠杆菌中成功实现了该基因的异源表达,并研究了相关的酶学性质。依据生物信息学的手段对该普鲁兰酶（PulPB1）的氨基酸序列及结构组成进行分析,基于蛋白质工程技术研究其N末端结构域在酶分子催化过程中的作用,并通过定点突变技术对该普鲁兰酶进行分子改造,提高了热稳定性。主要研究结果如下:1.将Bacillus methanolicus PB1基因组中的普鲁兰酶基因克隆至载体p...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同来源的普鲁兰酶结构示意图
第一章绪论5图1-2Ⅰ型普鲁兰酶催化多糖水解示意图（A）支链淀粉；（B）普鲁兰糖Fig.1-2SchematicdiagramofthehydrolysisofpullulanandamylopectinbytypeIpullulanase1.3普鲁兰酶的性质与应用1.3.1普鲁兰酶的性质研究报道的普鲁兰酶大多来源于嗜温菌，最适温度大部分都在50℃以上，稳定性较差；少部分的普鲁兰酶来源于嗜热菌，最适温度在75℃左右，稳定性相对较好，但酶活偏低[13]（表1-2）。普鲁兰酶的最适反应pH的分布范围为4.5–9.0，多数为5.0–6.5。目前，工业上在淀粉糖化时使用的多为酸性普鲁兰酶，例如，丹麦诺维信公司从嗜酸芽孢杆菌Bacillusacidopullulyticus中挖掘到的一种耐酸耐热的普鲁兰酶，最适pH在4.5–5.0之间，最适温度60℃[36,37]。由于其最适反应条件与糖化酶十分接近，催化效率与稳定性也比较好，因此被开发为商品酶应用于淀粉糖化过程。部分研究报道的冷适应型普鲁兰酶，最适温度在45℃左右，在淀粉冷水解工艺（又称生淀粉水解工艺：省去高温蒸煮糊化等程序，直接对生淀粉进行水解的方法）中具备一定的应用潜力，如表1-2中所示，来源于Bacilluspseudofirmus703及Exiguobacteriumsp.SH3的普鲁兰酶Pul703与Pul-SH3，最适温度均为45℃，且Pul703酶活达270U/mg。但是，冷适应型普鲁兰酶的最适pH往往为中性或弱碱性，与其他糖化酶所适合的弱酸（A）（B）
第二章BacillusmethanolicusPB1普鲁兰酶在大肠杆菌中的克隆表达及酶学性质研究23（16℃、20℃、25℃、30℃、37℃）和诱导时间（12、16、20、24、28h）对表达的重组普鲁兰酶活力的影响。其中菌液浓度测定（OD600）：使用没有接种的LB培养基作为空白调零，将菌液适当稀释至吸光度在0.2–0.8之间，用紫外分光光度计测定其在600nm处的吸光值。细胞湿重测定（DCW，g/L）：将诱导表达后的发酵液50mL置于称重后的离心管中，4℃，8000r/min离心5min弃去上清液，称量收集到的菌体质量，计算获得的菌体湿重。2.3.6重组蛋白的分离纯化2.3.6.1镍柱亲和层析纯化诱导表达后的菌体进行超声破碎得到普鲁兰酶粗酶液，用0.22μm的滤头过滤，然后利用伯乐蛋白纯化仪进行纯化。使用购于GE的5mL镍离子亲和层析柱，具体方法见操作说明书。2.3.6.2蛋白浓度及纯度的测定纯化得到的普鲁兰酶液采用Brad-Ford法测定蛋白浓度，首先以牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线，如图2-1所示。然后测定蛋白样品吸光值，根据标准曲线计算其浓度。具体的操作步骤见试剂盒说明书。图2-1牛血清蛋白浓度标准曲线Fig.2-1ThestandardcurveofBrad-FordmethodbasedonBSASDS-PAGE用于鉴定蛋白质纯度。具体操作如下：1．凝胶根据下表配制：
【参考文献】：
期刊论文
[1]燃料乙醇生料发酵技术现状[J]. 俞建良,熊强,张永新,刘劲松,林海龙. 酿酒科技. 2019(10)
[2]删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高（R）-ω-转氨酶热稳定性[J]. 谢东芳,吕常江,方卉,杨卫康,胡升,赵伟睿,黄俊,梅乐和. 生物工程学报. 2017(12)
[3]定向进化技术的最新进展[J]. 曲戈,赵晶,郑平,孙际宾,孙周通. 生物工程学报. 2018(01)
[4]酶分子稳定性改造研究进展[J]. 冯旭东,吕波,李春. 化工学报. 2016(01)
[5]理性设计提高β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性[J]. 汤恒,黄申,冯旭东,李春. 化工学报. 2015(06)
[6]响应面法优化玉米抗性淀粉制备工艺[J]. 张焕新,于博,金征宇. 食品科学. 2011(22)
[7]普鲁兰酶的应用对柠檬酸发酵的影响研究[J]. 石鹤,胡远亮. 中国酿造. 2010(03)
[8]洗涤剂中的淀粉酶[J]. 徐清. 日用化学品科学. 1997(05)
博士论文
[1]普鲁兰酶催化效率强化的分子改造及其分泌表达调控[D]. 王馨叶.江南大学 2019
[2]新型耐热普鲁兰酶的筛选、分子改良及固定化研究[D]. 王剑锋.江南大学 2018
[3]重组Bacillus deramificans普鲁兰酶的高效胞外表达及其应用[D]. 邹纯.江南大学 2016
[4]Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶可溶性高效表达及热稳定性分子改造[D]. 陈阿娜.江南大学 2016
[5]阿魏酸酯酶AuFaeA的热稳定性改造及其与木聚糖酶的协同作用[D]. 殷欣.江南大学 2015
[6]普鲁兰酶的产生菌筛选及其表达与分泌调控[D]. 陈文波.江南大学 2013
硕士论文
[1]Alteromonas sp. Y-389普鲁兰酶的分子改造及其热稳定性研究[D]. 魏家强.自然资源部第一海洋研究所 2019
[2]产普鲁兰酶菌株的筛选、基因克隆表达及酶学性质研究[D]. 苏红玉.华南理工大学 2019
[3]普鲁兰酶的重组表达、发酵优化及其在海藻糖制备中的应用[D]. 杨向会.江南大学 2018
[4]重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达[D]. 王海.华南理工大学 2018
[5]生淀粉酶酶解高浓度玉米淀粉乳的研究[D]. 房丹.江南大学 2016
[6]普鲁兰酶基因挖掘、酶学性质及结构域进化研究[D]. 陈思齐.华东理工大学 2016
[7]生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质研究[D]. 韦荣霞.江南大学 2013
本文编号：3134642
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同来源的普鲁兰酶结构示意图
第一章绪论5图1-2Ⅰ型普鲁兰酶催化多糖水解示意图（A）支链淀粉；（B）普鲁兰糖Fig.1-2SchematicdiagramofthehydrolysisofpullulanandamylopectinbytypeIpullulanase1.3普鲁兰酶的性质与应用1.3.1普鲁兰酶的性质研究报道的普鲁兰酶大多来源于嗜温菌，最适温度大部分都在50℃以上，稳定性较差；少部分的普鲁兰酶来源于嗜热菌，最适温度在75℃左右，稳定性相对较好，但酶活偏低[13]（表1-2）。普鲁兰酶的最适反应pH的分布范围为4.5–9.0，多数为5.0–6.5。目前，工业上在淀粉糖化时使用的多为酸性普鲁兰酶，例如，丹麦诺维信公司从嗜酸芽孢杆菌Bacillusacidopullulyticus中挖掘到的一种耐酸耐热的普鲁兰酶，最适pH在4.5–5.0之间，最适温度60℃[36,37]。由于其最适反应条件与糖化酶十分接近，催化效率与稳定性也比较好，因此被开发为商品酶应用于淀粉糖化过程。部分研究报道的冷适应型普鲁兰酶，最适温度在45℃左右，在淀粉冷水解工艺（又称生淀粉水解工艺：省去高温蒸煮糊化等程序，直接对生淀粉进行水解的方法）中具备一定的应用潜力，如表1-2中所示，来源于Bacilluspseudofirmus703及Exiguobacteriumsp.SH3的普鲁兰酶Pul703与Pul-SH3，最适温度均为45℃，且Pul703酶活达270U/mg。但是，冷适应型普鲁兰酶的最适pH往往为中性或弱碱性，与其他糖化酶所适合的弱酸（A）（B）
第二章BacillusmethanolicusPB1普鲁兰酶在大肠杆菌中的克隆表达及酶学性质研究23（16℃、20℃、25℃、30℃、37℃）和诱导时间（12、16、20、24、28h）对表达的重组普鲁兰酶活力的影响。其中菌液浓度测定（OD600）：使用没有接种的LB培养基作为空白调零，将菌液适当稀释至吸光度在0.2–0.8之间，用紫外分光光度计测定其在600nm处的吸光值。细胞湿重测定（DCW，g/L）：将诱导表达后的发酵液50mL置于称重后的离心管中，4℃，8000r/min离心5min弃去上清液，称量收集到的菌体质量，计算获得的菌体湿重。2.3.6重组蛋白的分离纯化2.3.6.1镍柱亲和层析纯化诱导表达后的菌体进行超声破碎得到普鲁兰酶粗酶液，用0.22μm的滤头过滤，然后利用伯乐蛋白纯化仪进行纯化。使用购于GE的5mL镍离子亲和层析柱，具体方法见操作说明书。2.3.6.2蛋白浓度及纯度的测定纯化得到的普鲁兰酶液采用Brad-Ford法测定蛋白浓度，首先以牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线，如图2-1所示。然后测定蛋白样品吸光值，根据标准曲线计算其浓度。具体的操作步骤见试剂盒说明书。图2-1牛血清蛋白浓度标准曲线Fig.2-1ThestandardcurveofBrad-FordmethodbasedonBSASDS-PAGE用于鉴定蛋白质纯度。具体操作如下：1．凝胶根据下表配制：
【参考文献】：
期刊论文
[1]燃料乙醇生料发酵技术现状[J]. 俞建良,熊强,张永新,刘劲松,林海龙. 酿酒科技. 2019(10)
[2]删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高（R）-ω-转氨酶热稳定性[J]. 谢东芳,吕常江,方卉,杨卫康,胡升,赵伟睿,黄俊,梅乐和. 生物工程学报. 2017(12)
[3]定向进化技术的最新进展[J]. 曲戈,赵晶,郑平,孙际宾,孙周通. 生物工程学报. 2018(01)
[4]酶分子稳定性改造研究进展[J]. 冯旭东,吕波,李春. 化工学报. 2016(01)
[5]理性设计提高β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性[J]. 汤恒,黄申,冯旭东,李春. 化工学报. 2015(06)
[6]响应面法优化玉米抗性淀粉制备工艺[J]. 张焕新,于博,金征宇. 食品科学. 2011(22)
[7]普鲁兰酶的应用对柠檬酸发酵的影响研究[J]. 石鹤,胡远亮. 中国酿造. 2010(03)
[8]洗涤剂中的淀粉酶[J]. 徐清. 日用化学品科学. 1997(05)
博士论文
[1]普鲁兰酶催化效率强化的分子改造及其分泌表达调控[D]. 王馨叶.江南大学 2019
[2]新型耐热普鲁兰酶的筛选、分子改良及固定化研究[D]. 王剑锋.江南大学 2018
[3]重组Bacillus deramificans普鲁兰酶的高效胞外表达及其应用[D]. 邹纯.江南大学 2016
[4]Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶可溶性高效表达及热稳定性分子改造[D]. 陈阿娜.江南大学 2016
[5]阿魏酸酯酶AuFaeA的热稳定性改造及其与木聚糖酶的协同作用[D]. 殷欣.江南大学 2015
[6]普鲁兰酶的产生菌筛选及其表达与分泌调控[D]. 陈文波.江南大学 2013
硕士论文
[1]Alteromonas sp. Y-389普鲁兰酶的分子改造及其热稳定性研究[D]. 魏家强.自然资源部第一海洋研究所 2019
[2]产普鲁兰酶菌株的筛选、基因克隆表达及酶学性质研究[D]. 苏红玉.华南理工大学 2019
[3]普鲁兰酶的重组表达、发酵优化及其在海藻糖制备中的应用[D]. 杨向会.江南大学 2018
[4]重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达[D]. 王海.华南理工大学 2018
[5]生淀粉酶酶解高浓度玉米淀粉乳的研究[D]. 房丹.江南大学 2016
[6]普鲁兰酶基因挖掘、酶学性质及结构域进化研究[D]. 陈思齐.华东理工大学 2016
[7]生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质研究[D]. 韦荣霞.江南大学 2013
本文编号：3134642
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