双酶转化富马酸生产β-丙氨酸的研究
发布时间：2021-04-18 04:19
β-丙氨酸是天然存在的唯一β-型氨基酸,是辅酶A和泛酸等功能性化合物合成的前体。和传统化学合成法相比,以L-天冬氨酸为底物的酶转化法反应温和、转化率高,是目前最受关注的β-丙氨酸生物制备方法之一。但是其关键酶L-天冬氨酸α-脱羧酶（PanD）存在严重的机制性失活,且底物价格昂贵,限制了规模化生产。本研究发展了以廉价的富马酸为起始底物,通过偶联PanD和L-天冬氨酸酶（AspA）催化富马酸生成β-丙氨酸的工艺路线。通过蛋白质工程改造,提高PanD的催化稳定性,进一步结合蛋白表达调控策略,优化共表达菌株双酶表达水平,使AspA和PanD具有良好的协同性,显著提高了级联路径的转化效率。主要研究结果如下:（1）设计、构建与验证了级联生产β-丙氨酸的路径。首先,筛选到Bacillus subtilis来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶（BsPanD）和Escherichia coli来源的L-天冬氨酸酶（EcAspA）作为级联反应的路径酶;其次,体外反应检测到产物β-丙氨酸的生成,验证了该级联路径的可行性;最后,通过体内转化反应,鉴定了PanD存在严重的机制性失活现象,导致催化稳定性差,是该级联反应的...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
β-丙氨酸化学结构式Fig.1-1Chemicalstructuralformulaofβ-alanine.
?原核生物来源的PanD酶催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸的反应过程高度相似，具体可被分成四步，以晶体结构已经被解析的M.tuberculosis为例进行介绍[43]，如图1-2所示：(1)PanD自剪切后在Ser25处形成的丙酮酰基团和底物L-天冬氨酸形成了一个席夫碱结构；(2)第一步中生成的酶-底物席夫碱的中间体通过脱羧作用，释放二氧化碳，从而形成一个烯醇结构；(3)Tyr58酚基上的“H+”攻击第二步中生成的烯醇结构的中间体，形成β-丙氨酸的亚胺加合物；(4)酶与产物的复合物通过水解作用释放产物β-丙氨酸，丙酮酰基团(活性基团)再生。图1-2L-天冬氨酸α-脱羧酶催化反应机理Fig.1-2MechanismofPanDcatalysispathways.1.3.3L-天冬氨酸α-脱羧酶的蛋白质改造进展蛋白质工程改造能够解决天然酶酶活低、稳定性差、产物抑制等问题，因此，它被广泛应用于酶法生产化学品的研究中[44-46]。近几年，L-天冬氨酸α-脱羧酶在蛋白质工程改造方面也得到了一定的发展。因为本文研究的是原核生物来源的PanD，所以，这里仅介绍了这类来源的PanD蛋白质工程改造进展。原核生物来源的PanD的改造多集中
3.1级联反应生产β-丙氨酸的设计、构建和验证3.1.1级联路径的设计级联催化富马酸生产β-丙氨酸的反应分为两步：(1)富马酸经过L-天冬氨酸酶(AspA)的加氨作用生成L-天冬氨酸；(2)L-天冬氨酸经过L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)的脱羧作用生成β-丙氨酸。通过偶联AspA和PanD，可以实现一锅法转化富马酸制备β-丙氨酸。基于BRENDA数据库中的比酶活数据，分别筛选出6种不同来源的PanD和6种不同来源的AspA，再通过分子生物学手段在E.coli中异源表达这些潜在催化效率较高的蛋白，比较并最终选定最适的酶源，从而实现级联路径的构建。图3-1级联反应催化富马酸生成β-丙氨酸的路径设计Fig.3-1Designandreconstructionofβ-alaninebiosynthesispathwayfromfumaricacidbythedual-enzymesystemcontainingAspAandPanD.3.1.2L-天冬氨酸α-脱羧酶重组菌的构建以枯草芽孢杆菌B.subtilis来源的PanD菌株构建为例，构建过程如下：(1)将B.subtilis活化培养，按照步骤2.2.1所述方法提取其基因组，利用扩增引物BsPanD-S和BsPanD-A，以提取的B.subtilis基因组为模板，克隆panD基因，再利用BamHI和HindIII酶切位点将其插入到pET28a(+)质粒(具体构建流程见步骤2.2.3)，构建完成的菌株命名为pET28a-BsPanD。(2)使用TB培养基对重组菌株pET28a-BsPanD进行培养和诱导表达，然后收集菌体、重悬并进行超声破碎，再利用His亲和柱进行纯化，纯化效果由SDS-PAGE验证。如图3-2(B)所示，在12kDa左右有较粗的蛋白条带，与BsPanD的理论分子量一致，证明了BsPanD在E.coli中实现了可溶性表达，且纯化出的条带单一，纯化效果较好。(3)对纯化出的BsPanD蛋白进行体外酶活测定，如表3-1所示，BsPanD的比酶活为3.25U·mg-1protein。按照上述步骤(1)获得来源于C.glutamicum的PanD编码基因，此外，通
【参考文献】：
期刊论文
[1]β-氨基丙酸的合成与应用[J]. 罗积杏,薛建萍,沈寅初. 氨基酸和生物资源. 2005(01)
博士论文
[1]薯蓣皂素的酶促糖基化以及相关化合物的生物合成研究[D]. 董青.华东理工大学 2011
硕士论文
[1]L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造及其在β-丙氨酸生产中的应用[D]. 陈虹.浙江工业大学 2019
[2]构象动力学方法改造酶性能以生产医药中间体[D]. 杨彬.江南大学 2018
[3]L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸[D]. 张腾辉.江南大学 2018
[4]一釜双酶法转化富马酸制备β-丙氨酸催化体系的构建及工艺优化[D]. 高宇.江南大学 2017
[5]代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸[D]. 梁姗姗.江南大学 2017
[6]β-丙氨酸对肉仔鸡生产性能、肌肉品质和肌源活性肽的影响[D]. 齐博.中国农业科学院 2017
[7]L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究[D]. 高丽娟.浙江工业大学 2007
本文编号：3144789
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
β-丙氨酸化学结构式Fig.1-1Chemicalstructuralformulaofβ-alanine.
?原核生物来源的PanD酶催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸的反应过程高度相似，具体可被分成四步，以晶体结构已经被解析的M.tuberculosis为例进行介绍[43]，如图1-2所示：(1)PanD自剪切后在Ser25处形成的丙酮酰基团和底物L-天冬氨酸形成了一个席夫碱结构；(2)第一步中生成的酶-底物席夫碱的中间体通过脱羧作用，释放二氧化碳，从而形成一个烯醇结构；(3)Tyr58酚基上的“H+”攻击第二步中生成的烯醇结构的中间体，形成β-丙氨酸的亚胺加合物；(4)酶与产物的复合物通过水解作用释放产物β-丙氨酸，丙酮酰基团(活性基团)再生。图1-2L-天冬氨酸α-脱羧酶催化反应机理Fig.1-2MechanismofPanDcatalysispathways.1.3.3L-天冬氨酸α-脱羧酶的蛋白质改造进展蛋白质工程改造能够解决天然酶酶活低、稳定性差、产物抑制等问题，因此，它被广泛应用于酶法生产化学品的研究中[44-46]。近几年，L-天冬氨酸α-脱羧酶在蛋白质工程改造方面也得到了一定的发展。因为本文研究的是原核生物来源的PanD，所以，这里仅介绍了这类来源的PanD蛋白质工程改造进展。原核生物来源的PanD的改造多集中
3.1级联反应生产β-丙氨酸的设计、构建和验证3.1.1级联路径的设计级联催化富马酸生产β-丙氨酸的反应分为两步：(1)富马酸经过L-天冬氨酸酶(AspA)的加氨作用生成L-天冬氨酸；(2)L-天冬氨酸经过L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)的脱羧作用生成β-丙氨酸。通过偶联AspA和PanD，可以实现一锅法转化富马酸制备β-丙氨酸。基于BRENDA数据库中的比酶活数据，分别筛选出6种不同来源的PanD和6种不同来源的AspA，再通过分子生物学手段在E.coli中异源表达这些潜在催化效率较高的蛋白，比较并最终选定最适的酶源，从而实现级联路径的构建。图3-1级联反应催化富马酸生成β-丙氨酸的路径设计Fig.3-1Designandreconstructionofβ-alaninebiosynthesispathwayfromfumaricacidbythedual-enzymesystemcontainingAspAandPanD.3.1.2L-天冬氨酸α-脱羧酶重组菌的构建以枯草芽孢杆菌B.subtilis来源的PanD菌株构建为例，构建过程如下：(1)将B.subtilis活化培养，按照步骤2.2.1所述方法提取其基因组，利用扩增引物BsPanD-S和BsPanD-A，以提取的B.subtilis基因组为模板，克隆panD基因，再利用BamHI和HindIII酶切位点将其插入到pET28a(+)质粒(具体构建流程见步骤2.2.3)，构建完成的菌株命名为pET28a-BsPanD。(2)使用TB培养基对重组菌株pET28a-BsPanD进行培养和诱导表达，然后收集菌体、重悬并进行超声破碎，再利用His亲和柱进行纯化，纯化效果由SDS-PAGE验证。如图3-2(B)所示，在12kDa左右有较粗的蛋白条带，与BsPanD的理论分子量一致，证明了BsPanD在E.coli中实现了可溶性表达，且纯化出的条带单一，纯化效果较好。(3)对纯化出的BsPanD蛋白进行体外酶活测定，如表3-1所示，BsPanD的比酶活为3.25U·mg-1protein。按照上述步骤(1)获得来源于C.glutamicum的PanD编码基因，此外，通
【参考文献】：
期刊论文
[1]β-氨基丙酸的合成与应用[J]. 罗积杏,薛建萍,沈寅初. 氨基酸和生物资源. 2005(01)
博士论文
[1]薯蓣皂素的酶促糖基化以及相关化合物的生物合成研究[D]. 董青.华东理工大学 2011
硕士论文
[1]L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造及其在β-丙氨酸生产中的应用[D]. 陈虹.浙江工业大学 2019
[2]构象动力学方法改造酶性能以生产医药中间体[D]. 杨彬.江南大学 2018
[3]L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸[D]. 张腾辉.江南大学 2018
[4]一釜双酶法转化富马酸制备β-丙氨酸催化体系的构建及工艺优化[D]. 高宇.江南大学 2017
[5]代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸[D]. 梁姗姗.江南大学 2017
[6]β-丙氨酸对肉仔鸡生产性能、肌肉品质和肌源活性肽的影响[D]. 齐博.中国农业科学院 2017
[7]L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究[D]. 高丽娟.浙江工业大学 2007
本文编号：3144789
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