功能表达来源于Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1的腈水合酶及其应用

发布时间：2021-04-27 05:09

　　腈水合酶（EC 4.2.1.84）是微生物体内代谢臆类物质的关键酶之一,可以催化腈水合成相应的酰胺。由于其催化效率高、反应条件温和、环境友好等特点,腈水合酶已经成功的应用于化学工业中合成酰胺类物质。腈水合酶基因一般以基因簇形式存在,包含α亚基,β亚基和激活蛋白。本实验室前期将来源于Aurantingaas manganoxydans SI85-9A1的腈水合酶基因NH08克隆并构建在重组大肠杆菌中。然而,β亚基的表达量远远低于α亚基,激活蛋白表达量也偏低。本文首先通过融合标签策略、双质粒策略、多顺反子策略等一系列研究,使激活蛋白的表达量提高了 5.14倍,酶活提高了 44.6%,达到120U/mL。其次,通过同义突变策略,使β亚基的表达量提高了 33%,最终酶活达到160U/mL。比酶活达到了 620.2U/mg,提高了 52.9%。再次,通过摇瓶培养条件优化,酶活达到了 1531.2U/mL,OD600达到了 15.6。最后在15L罐中进行高密度发酵,酶活达到了 9080U/mL,OD600达到123。目前谷氨酸棒杆菌被广泛的应用于代谢工程研究中,利用其为宿主进行蛋白表达的研究相对较... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

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致谢
摘要
Abstract
缩写符号术语表
第一章 绪论
    1.1 腈水合酶概述
        1.1.1 腈水合酶的来源
        1.1.2 腈水合酶的种类
        1.1.3 腈水合酶的结构特征
        1.1.4 腈水合酶的催化机理
        1.1.5 腈水合酶的性质
    1.2 常见酶的表达体系和表达优化
        1.2.1 酶的表达体系
            1.2.1.1 大肠杆菌
            1.2.1.2 枯草芽孢杆菌
            1.2.1.3 谷氨酸棒杆菌
            1.2.1.4 酵母
        1.2.2 表达优化
            1.2.2.1 复制子
            1.2.2.2 启动子
            1.2.2.3 密码子
            1.2.2.4 翻译起始区域
            1.2.2.5 融合标签
            1.2.2.6 高密度发酵
    1.3 腈水合酶的重组表达现状
        1.3.1 腈水合酶在大肠杆菌中的表达
        1.3.2 腈水合酶在其他宿主中的表达
    1.4 腈水合酶的工业应用
        1.4.1 医药化工行业
        1.4.2 精细化工行业
        1.4.3 食品饲料添加剂行业
        1.4.4 环境修复
    1.5 论文的研究目标
    1.6 论文的研究思路和内容
第二章 大肠杆菌中腈水合酶的增强表达
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 实验药品与试剂
        2.2.3 培养基与试剂配制
        2.2.4 菌种和质粒
        2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制作
        2.2.6 转化与验证
        2.2.7 DNA操作
            2.2.7.1 质粒提取
            2.2.7.2 普通PCR
            2.2.7.3 重叠延伸PCR
            2.2.7.4 全质粒PCR定点突变
            2.2.7.5 DNA凝胶回收
            2.2.7.6 快速克隆
        2.2.8 表达载体构建
            2.2.8.1 载体pCDFDuet-acc的构建
            2.2.8.2 载体pCDFDuet-acc（SK）的构建
            2.2.8.3 载体pCDFDuet-acc（SKI）的构建
            2.2.8.4 载体pCDFDuet-acc（SKIK）的构建
            2.2.8.5 载体pET28-α-β-acc（SKI）的构建
            2.2.8.6 载体pET28-α-β-acc（SKIK）的构建
            2.2.8.7 载体pCDFDuet-β的构建
            2.2.8.8 载体pCDFDuet-β（SKI）的构建
            2.2.8.9 载体pCDFDuet-β（SKIK）的构建
            2.2.8.10 载体pET28-α-β（SKI）-acc（SKIK）的构建
            2.2.8.11 载体pET28-α-β（SKIK）-acc（SKIK）的构建
            2.2.8.12 载体pET28-α（mut）-β-acc（SKIK）的构建
        2.2.9 mRNA结构分析
        2.2.10 重组腈水合酶的诱导和表达
        2.2.11 菌体收集和细胞破碎
        2.2.12 SDS-PAGE电泳
        2.2.13 蛋白质纯化
        2.2.14 腈水合酶酶活测定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 激活蛋白的增强表达
            2.3.1.1 激活蛋白单质粒表达
            2.3.1.2 双质粒共表达策略
            2.3.1.3 多顺反子策略
        2.3.2 β亚基的增强表达
            2.3.2.1 β亚基单独增强表达
            2.3.2.2 多顺反子策略
            2.3.2.3 同义突变策略
        2.3.3 重组腈水合酶的纯化与比酶活测定
    2.4 本章小结
第三章 谷氨酸棒杆菌异源表达腈水合酶系统构建
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 实验药品与试剂
        3.2.3 培养基配制
        3.2.4 质粒与菌种
        3.2.5 感受态细胞制作
        3.2.6 转化与验证
        3.2.7 DNA操作
        3.2.8 表达载体的构建
            3.2.8.1 载体pXMJ 19-P43-NH08的构建
            3.2.8.2 载体pXMJ 19-PilvC-NH08的构建
            3.2.8.3 载体pEC-XK99E-NH08的构建
            3.2.8.4 载体pEKEX2-NH08的构建
            3.2.8.5 载体pEKEX2-NHopt的构建
            3.2.8.6 载体pEKEX2-SD50000-NHopt的构建
            3.2.8.7 载体pEKEX2-SD 100000-NHopt的构建
            3.2.8.8 载体pEKEX2-mmp-SD50000-NHopt的构建
            3.2.8.9 载体pEKEX2-de3-SD50000-NHopt的构建
        3.2.9 密码子优化
        3.2.10 SD序列设计
        3.2.11 重组腈水合酶的诱导和表达
        3.2.12 菌体收集和细胞破碎
        3.2.13 SDS-PAGE
        3.2.14 腈水合酶酶活测定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 腈水合酶的组成型表达
        3.3.2 腈水合酶的诱导型表达
        3.3.3 密码子优化
        3.3.4 SD序列的设计
        3.3.5 新型表达系统的引入
    3.4 本章小结
第四章 重组大肠杆菌发酵
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 实验药品与试剂
        4.2.3 菌株
        4.2.4 培养基
        4.2.5 培养方法
        4.2.6 摇瓶优化
        4.2.7 分析方法
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 培养基优化
            4.3.1.1 不同氮源比较
            4.3.1.2 复合氮源优化
            4.3.1.3 复合氮源比例优化
            4.3.1.4 复合氮源浓度优化
            4.3.1.5 不同碳源比较
            4.3.1.6 碳源浓度比较
        4.3.2 诱导条件优化
            4.3.2.1 不同诱导剂比较
            4.3.2.2 诱导剂浓度优化
            4.3.2.3 钴离子浓度优化
            4.3.2.4 诱导温度优化
        4.3.3 重组大肠杆菌的发酵实验
    4.4 本章小结
第五章 重组谷氨酸棒杆菌发酵
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 实验仪器
        5.2.2 实验药品与试剂
        5.2.3 发酵菌种
        5.2.4 培养基
        5.2.5 培养方法
        5.2.6 摇瓶优化
        5.2.7 分析方法
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 培养基优化
            5.3.1.1 不同氮源比较
            5.3.1.2 氮源浓度优化
            5.3.1.3 不同碳源比较
            5.3.1.4 生长因子优化
        5.3.2 诱导条件优化
            5.3.2.1 IPTG浓度
            5.3.2.2 钴离子浓度
            5.3.2.3 诱导温度
        5.3.3 重组谷氨酸棒杆菌的发酵实验
    5.4 本章小结
第六章 重组腈水合酶催化制备酰胺初探
    6.1 引言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 实验仪器
        6.2.2 实验药品与试剂
        6.2.3 菌株
        6.2.4 培养基及培养方法
        6.2.5 静息细胞的制备
        6.2.6 全细胞催化制备酰胺
            6.2.6.1 重组大肠杆菌分批补料催化制备烟酰胺
            6.2.6.2 重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化制备烟酰胺
            6.2.6.3 重组大肠杆菌催化制备2,6-二氟苯甲酰胺
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 重组大肠杆菌制备烟酰胺
        6.3.2 重组谷氨酸棒杆菌制备烟酰胺
            6.3.2.1 温度和温度稳定性
            6.3.2.2 最适pH
            6.3.2.3 不同底物浓度对反应的影响
            6.3.2.4 分批补料制备烟酰胺
        6.3.3 重组大肠杆菌制备2,6-二氟苯甲酰胺工艺研究
            6.3.3.1 最适温度和温度稳定性
            6.3.3.2 最适pH和无缓冲液催化体系
            6.3.3.3 助溶剂的筛选
            6.3.3.4 不同底物投料方式比较
            6.3.3.5 底物添加量对反应影响
            6.3.3.6 50 L反应体系
    6.4 本章小结
第七章 结论与展望
    7.1 结论
    7.2 本论文的创新点
    7.3 展望
参考文献
附录
在学期间所取得的科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母表达系统研究概述[J]. 田晓娟.  陇东学院学报. 2018(01)
[2]ISOLATION,CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF THE COMPLEMENTARY DNA FOR HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR （TNF-α）[J]. 肖蕾,田园,王秀琴,贾凤兰,吴旻.  Science in China,Ser.B. 1990(10)



本文编号：3162830