易错PCR技术提高谷氨酸脱羧酶催化效率的研究

发布时间：2021-06-16 16:31

　　γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛存在于植物、动物和微生物体内的非蛋白质氨基酸,具有降血压、抗焦虑、调节激素分泌等多种生理功能,在食品、医药和化工领域都有很重要的应用价值。谷氨酸脱羧酶（GAD）通过脱羧作用将谷氨酸（Glu）转化为GABA。因此,筛选高比酶活力的谷氨酸脱羧酶突变体并建立相应的高密度发酵工艺具有重要的意义。首先,建立了谷氨酸脱羧酶突变体的高通量筛选体系。根据全细胞转化Glu生成GABA过程中的pH变化规律,选择氯酚红-溴甲酚绿钠酸碱指示剂,确立指示剂比例为1:1,筛选浓度为0.6%（v/v）,Glu底物浓度为10g/L的显色体系,建立了抗性平板初筛,深孔板培养单菌落,96孔板转化,酶标仪OD575/OD600扫描比对分析,摇瓶复筛的高通量筛选体系。其次,获得了Glu转化效率提高的工程菌。通过易错PCR技术构建GAD突变体文库,利用构建的筛选体系获得三株转化效率提高且耐热性改善的工程菌。菌株BW（△C）/PYB1 S-L bgadBV209V/T237S/C379C/V406V在55℃条件下孵育3 h后,转化（45℃）400 g/L Glu,反应4 h时GABA的含量达到2... 

【文章来源】：福建师范大学福建省

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１全细胞催化过程ｐＨ变化??Ｆｉｇ．?１－１?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｐＨ?ｉｎ?ｗｈｏｌｅ?－Ｃｅｌｌ?Ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ??

福建师范大学魏杰硕士学位论文??图１－１表示全细胞催化过程中的ｐＨ变化，转化初始ｐＨ在３．４左右，前半小时??ｐＨ上升很快是因为体系内谷氨酸开始转化为中性的ＧＡＢＡ，而体系内的谷氨酸溶??解度很低，从而使ｐＨ上升很快，当体系中的ｐＨ上升至４．２－５．０之间时，上升趋势??减缓是因为此时的ｐＨ处于ＧＡＤ的活性最适ｐＨ范围，谷氨酸的转化速率和ＧＡＢＡ??合成速率不断加快，本实验室前期的实验研宄表明ＧＡＢＡ有促进谷氨酸溶解的作??用，因此体系中谷氨酸的转化速率和溶解速率相互中和，当ｐＨ上升至５．０后上升趋??势加快然后趋于平缓，是因为处于转化后期，体系中的谷氨酸完全溶解并且含量逐??渐减少，此时ＧＡＤ的活力逐渐丧失，导致谷氨酸基本转化不动，反应速率下降，??ｐＨ上升缓慢

Ｆｉｇ．?１－６?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ?ｒａｔｉｏ??Ａ：?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ?ｏｆ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒ?Ｂ：?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?Ｃｏｌｏｒ?ｏｆ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒ??由图１－６Ｂ可知，不同比例的指示剂的颜色在不同ｐＨ下的变化有明显区别。当??ｐＨ升高至５．２以后，溴甲酚绿钠指示剂的比例增加使颜色偏向于蓝色，并且变化很??小，当氯酚红指示剂的比例增加吋，颜色偏向于红色；当ｐＨ＜３．７时，各比例指示??剂颜色都为黄色，说明该指示剂在ｐＨ?３．７以上才有颜色变化；ｐＨ在４．７－５．２之间时，??处于转化过程ｐＨ转折点（ｐＨ?５．０），指示剂比例为１：１时颜色由蓝绿色到深蓝色再??到紫色，而其他比例的指示剂在这一区间颜色变化不明显。图Ａ为不同比例指示剂??在５７５?ｎｍ下的吸光度（全波长扫描各比例指不剂的最大吸收波长均为５７５?ｎｍ），??指示剂比例为１：１时的吸光度值变化最大，其它比例的指示剂吸光度值变化较小，??因此选择氯酚红－溴甲酚绿钠指示剂的比例为１：１

【参考文献】：
期刊论文
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[3]采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化[J]. 刘治江,贺淹才,李红然,刘嘉,施腾鑫.  华侨大学学报(自然科学版). 2010(01)
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硕士论文
[1]转化法合成γ-氨基丁酸的霉菌筛选及条件优化[D]. 田东亮.齐鲁工业大学 2013
[2]微生物细胞催化合成γ-氨基丁酸（GABA）的研究[D]. 韩雪.哈尔滨商业大学 2013



本文编号：3233406