代谢工程改造酿酒酵母高效生产α-檀香烯的研究
发布时间：2021-07-01 21:10
檀香精油是目前世界上最昂贵的香料之一,其主要成分为檀香醇。檀香烯是檀香醇的前体化合物。为实现檀香烯的高效生产,本文通过对檀香烯合酶的表达调控以及内源萜类代谢途径的改造,利用酿酒酵母构建高效生物合成α-檀香烯的细胞工厂。本文首先考察了酿酒酵母中CPRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率。结果表明,利用上下游为200-500 bp的同源臂,可以对2000bp-7000 bp的目标位点进行敲除,编辑效率为100%;利用引物引入40 bp的同源区,能够高效实现1000-10000 bp的片段的插入。以酿酒酵母CENPK2-1C和BY4741为出发菌株,将tHMG1和ERG20表达组件分别整合至DPP1、LPP1位点来提高MVA途径的代谢强度。通过引入外源的檀香烯合酶在酵母工程菌中构建檀香烯的生物合成途径,并考察了启动子强度,宿主细胞以及表达质粒拷贝数对于α-檀香烯产量的影响。结果表明,以酿酒酵母SCN02为宿主细胞,以高拷贝质粒为表达载体,以启动子pTEF1来表达檀香烯合酶的α-檀香烯产量最高,达到12.7 mg/L。在此基础上对下游的角鲨烯途径进行了弱化,檀香烯产量进一步提高至24.7m...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径（Ａ）和２－甲基－４磷酸－４－Ｄ－赤藓糖醇（ＭＥＰ）途径（Ｂ）示意??
Ｆｉｇ．?１．３?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｇｅｎｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ??１．５．１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用与发展??Ｄｏｕｄｎａ与Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ两个团队合作对化脓链球菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统进行??改造，将?ｔｒａｃｒＲＮＡ?和?ｃｒＲＮＡ?整合为一条单链，称为?ｃｒＲＮＡ：?ｔｒａｃｒＲＮＡ?ｃｈｉｍｅｒａ，??成功实现了体外的ＤＮＡ精确切割［６７］。张锋课题组利用链球菌ＩＩ型Ｃａｓ９系统，??通过外源表达的单链向导（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅｄ?ＲＮＡ，ｓｇＲＮＡ；?ｔｒａｃｒＲＮＡ与ｃｒＲＮＡ通??过短ＲＮＡ连接在一起），可以引导Ｃａｓ９切割哺乳动物细胞基因组，并引发同源??重组修复（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ?Ｒｅｐａｉｒ，ＨＤＲ?）或非同源的末端连接??（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?Ｅｎｄ?Ｊｏｉｎｉｎｇ，?ＮＨＥＪ）介导的基因组编辑［６８］利用?Ｃａｓ９ｎ?与具有??碱基修饰功能的蛋白融合可以对基因组特定位点进行单碱基突变，并且避免了双??链断裂［６９’７Ｇ］。如Ｋｏｍｏｒ等人将Ｃａｓ９ｎ与脱氨酶（Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）和尿墙卩定糖基酶抑??２４??
图２．１?ＤＮＡ片段制备过程（Ａ）基因敲除用的同源臂制备（Ｂ）基因插入ＤＮＡ片段制Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ．??．７．２酿酒酵母利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９进行基因编辑方法??１．将Ｃａｓ９基因表达质粒转化到酿酒酵母中，转化方法参考本章，用潮霉素筛．将ｓｇＲＮＡ质粒和同源片段转化到上一步转化含有Ｃａｓ９表达质粒的酿酒中，用潮霉素和Ｇ４１８的ＹＰＤ平板筛选，转化后挑取转化子验证??．将有正确基因型的转化子接入只含有潮霉素的５ｍｌＹＰＤ试管中培养１２小取ｌＯＯｕｌ转接新鲜５ｍｌＹＰＤ试管中，添加潮霉素。连续转接３次，稀释１００倍后涂布于潮霉素ＹＰＤ固体平板。置于３０°Ｃ恒温培养箱中培养２－３天。签挑取单菌落于含有Ｇ４１８抗性的ＹＰＤ平板中，验证ｓｇＲＮＡ丟失情况。??．ｓＲＮＡ下一。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]天然药物紫杉醇的研究进展[J]. 王俊松. 当代化工研究. 2018(01)
[2]生物法合成食品香料的研究进展[J]. 范武,柴国璧,赵无垛,张文娟,毛健,杨伟平,屈展,宗永立,刘俊辉,张东豫. 化学通报. 2016(03)
[3]紫杉二烯生物合成模块与不同底盘的适配[J]. 张正伟,丁明珠,元英进. 高等学校化学学报. 2014(01)
[4]HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌产量的影响[J]. 孔建强,程克棣,王丽娜,郑晓东,戴均贵,朱平,王伟. 药学学报. 2007(12)
[5]植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用[J]. 朱长甫,陈星,王英典. 植物生理与分子生物学学报. 2004(06)
[6]胰岛素的应用[J]. 李全忠. 河南诊断与治疗杂志. 2002(01)
[7]狂犬病基因工程苗研究进展[J]. 秦翠丽,李松彪,李治力,张许科. 河南畜牧兽医. 2001(06)
博士论文
[1]类胡萝卜素高产菌株高效筛选及合成代谢调控研究[D]. 王红波.华中科技大学 2014
硕士论文
[1]启动子和载体对酵母人工细胞青蒿二烯产量的影响研究[D]. 王思佳.天津大学 2013
[2]青蒿二烯功能模块与酵母底盘的适配性研究[D]. 贾云婧.天津大学 2013
本文编号：3259874
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径（Ａ）和２－甲基－４磷酸－４－Ｄ－赤藓糖醇（ＭＥＰ）途径（Ｂ）示意??
Ｆｉｇ．?１．３?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｇｅｎｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ??１．５．１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用与发展??Ｄｏｕｄｎａ与Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ两个团队合作对化脓链球菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统进行??改造，将?ｔｒａｃｒＲＮＡ?和?ｃｒＲＮＡ?整合为一条单链，称为?ｃｒＲＮＡ：?ｔｒａｃｒＲＮＡ?ｃｈｉｍｅｒａ，??成功实现了体外的ＤＮＡ精确切割［６７］。张锋课题组利用链球菌ＩＩ型Ｃａｓ９系统，??通过外源表达的单链向导（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅｄ?ＲＮＡ，ｓｇＲＮＡ；?ｔｒａｃｒＲＮＡ与ｃｒＲＮＡ通??过短ＲＮＡ连接在一起），可以引导Ｃａｓ９切割哺乳动物细胞基因组，并引发同源??重组修复（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ?Ｒｅｐａｉｒ，ＨＤＲ?）或非同源的末端连接??（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?Ｅｎｄ?Ｊｏｉｎｉｎｇ，?ＮＨＥＪ）介导的基因组编辑［６８］利用?Ｃａｓ９ｎ?与具有??碱基修饰功能的蛋白融合可以对基因组特定位点进行单碱基突变，并且避免了双??链断裂［６９’７Ｇ］。如Ｋｏｍｏｒ等人将Ｃａｓ９ｎ与脱氨酶（Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）和尿墙卩定糖基酶抑??２４??
图２．１?ＤＮＡ片段制备过程（Ａ）基因敲除用的同源臂制备（Ｂ）基因插入ＤＮＡ片段制Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ．??．７．２酿酒酵母利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９进行基因编辑方法??１．将Ｃａｓ９基因表达质粒转化到酿酒酵母中，转化方法参考本章，用潮霉素筛．将ｓｇＲＮＡ质粒和同源片段转化到上一步转化含有Ｃａｓ９表达质粒的酿酒中，用潮霉素和Ｇ４１８的ＹＰＤ平板筛选，转化后挑取转化子验证??．将有正确基因型的转化子接入只含有潮霉素的５ｍｌＹＰＤ试管中培养１２小取ｌＯＯｕｌ转接新鲜５ｍｌＹＰＤ试管中，添加潮霉素。连续转接３次，稀释１００倍后涂布于潮霉素ＹＰＤ固体平板。置于３０°Ｃ恒温培养箱中培养２－３天。签挑取单菌落于含有Ｇ４１８抗性的ＹＰＤ平板中，验证ｓｇＲＮＡ丟失情况。??．ｓＲＮＡ下一。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]天然药物紫杉醇的研究进展[J]. 王俊松. 当代化工研究. 2018(01)
[2]生物法合成食品香料的研究进展[J]. 范武,柴国璧,赵无垛,张文娟,毛健,杨伟平,屈展,宗永立,刘俊辉,张东豫. 化学通报. 2016(03)
[3]紫杉二烯生物合成模块与不同底盘的适配[J]. 张正伟,丁明珠,元英进. 高等学校化学学报. 2014(01)
[4]HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌产量的影响[J]. 孔建强,程克棣,王丽娜,郑晓东,戴均贵,朱平,王伟. 药学学报. 2007(12)
[5]植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用[J]. 朱长甫,陈星,王英典. 植物生理与分子生物学学报. 2004(06)
[6]胰岛素的应用[J]. 李全忠. 河南诊断与治疗杂志. 2002(01)
[7]狂犬病基因工程苗研究进展[J]. 秦翠丽,李松彪,李治力,张许科. 河南畜牧兽医. 2001(06)
博士论文
[1]类胡萝卜素高产菌株高效筛选及合成代谢调控研究[D]. 王红波.华中科技大学 2014
硕士论文
[1]启动子和载体对酵母人工细胞青蒿二烯产量的影响研究[D]. 王思佳.天津大学 2013
[2]青蒿二烯功能模块与酵母底盘的适配性研究[D]. 贾云婧.天津大学 2013
本文编号：3259874
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