脂肪酶底物特异性改造及其在油脂水解中的应用
发布时间：2021-07-22 19:37
脂肪酸广泛应用于工业领域,尤其是不饱和长链脂肪酸对人体健康具有重要的作用。天然油脂含有大量的长链脂肪酸,酶水解法由于环境友好、设备简单和特异性等优势成为脂肪酸制备的主要方法。然而,对中链脂肪酸水解特异性较强的华根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase,RCL）,水解不饱和长链脂肪酸含量较高的天然油脂能力较弱,难以达到脂肪酸工业生产的水平。目前,关于酶的不饱和脂肪酸特异性改造研究较少,本文通过理性设计华根霉脂肪酶获得了对不饱和长链脂肪酸特异性增强的突变酶,该突变酶催化大豆油水解的能力相应地提高。最后采用介孔氧化硅固定化脂肪酶,初步研究了固定化脂肪酶在大豆油水解中的重复使用稳定性。具体内容包括:（1）针对华根霉脂肪酶的底物结合口袋理性设计了6个突变位点,利用全质粒PCR技术获得了突变酶L285Q、T286Q、HQL、A116W、I281F和A116W/I281F,并成功地在毕赤酵母中获得了表达。重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-RCLHQL的生长趋势与原始菌株相似。（2）考察了突变酶的底物特异性和酶学性质,突变酶HQL增强了对不饱和长链脂肪酸的特异性,对pN...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同脂肪酶结构示意图
图 2-1 重组质粒 pPIC9K-RCL 构建图谱. 2-1 Construction of cloning plasmid pPIC9K-）：10.00 g 胰蛋白胨，5.00 g 酵母提取物养基时加入 20.00 g 琼脂粉。1L）：20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提固体培养基时加入 20.00 g 琼脂粉。L）：13.40 g YNB，4×10-4g 生物素，20 min。）: 20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提取.0 磷酸钾缓冲液，13.40 g YNB，4×10）: 20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提取.0 磷酸钾缓冲液，13.40 g YNB，4×1
酶底物结合口袋中氨基酸的亲疏水性以及侧链基团大小等因素可能会影响脂肪酶的底物特异性。因此，根据华根霉脂肪酶（RCL）晶体结构分析和多序列同源比对，针对 RCL 底物结合口袋设计突变位点，从增加口袋亲水性的角度设计三个突变体，包括L285Q、T286Q 以及在序列 H284 和 L285 中间插入一个亲水氨基酸谷氨酰胺 Q，突变体命名为 HQL；从增加空间位阻的角度设计三个突变位点，包括 A116W、I281F 和A116W/I281F。由图 3-1(a)可知，S172、D231 和 H284 为脂肪酶催化三联体，“盖子”结构位于脂肪酶活性中心的上方， A116 位于“盖子”结构上，I281、L285 和 T286 位于底物结合口袋附近。突变后模拟结构如图 3-1(b)所示，盖子结构上 116 位的 A（丙氨酸）突变为 W（色氨酸）后，引入了一个杂环基团；底物结合口袋附近 281 位的 I（异亮氨酸）突变为 F（苯丙氨酸）后，引入了一个苯环基团；这两者均增加了空间位阻。底物结合口袋附近 285 位的 L（亮氨酸）、286 位的 T（苏氨酸）突变为 Q（谷氨酰胺）后，以及在 284 位的 H（组氨酸）与 285 位的 L 之间插入一个 Q 后，均增加了底物结合口袋的亲水性。RCL 氨基酸序列中共有 398 个氨基酸残基，包括 26 个氨基酸的信号肽序列，94 个氨基酸的前导肽序列和 278 个氨基酸的成熟肽序列。图 3-2 为 RCL 氨基酸序列图。
【参考文献】：
期刊论文
[1]毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶（r27RCLC）的糖基化鉴定[J]. 杨敏,喻晓蔚,吴厚军,徐岩. 食品与生物技术学报. 2014(10)
[2]肠道短链脂肪酸产生机制及生理功能的研究进展[J]. 刘松珍,张雁,张名位,孙远明,魏振承. 广东农业科学. 2013(11)
[3]基因拷贝数和甲醇浓度对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的影响[J]. 李飞,喻晓蔚,沙冲,徐岩. 微生物学通报. 2011(03)
[4]工业脂肪酸结晶分离方法概况[J]. 于艳艳,郭莹,陈克云. 科技信息. 2010(28)
[5]华根霉脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究[J]. 王楠,王栋,徐岩,周艺博. 食品工业科技. 2010(02)
[6]超声波对无溶剂体系脂肪酶催化大豆油水解的影响[J]. 黄健花,刘亚轩,金青哲,刘元法,王兴国. 中国油脂. 2009(06)
[7]华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达[J]. 王乐乐,喻晓蔚,徐岩. 高技术通讯. 2009(01)
[8]无溶剂体系中脂肪酶催化大豆油水解反应的研究[J]. 刘亚轩,金青哲,刘元法,王兴国. 中国油脂. 2008(10)
[9]假丝酵母脂肪酶催化底物水解的初步研究[J]. 董恒涛,吴晓英,刘仁春,林影. 现代食品科技. 2008(07)
[10]华根霉胞内脂肪酶同功酶酶学性质研究[J]. 阮振华,王栋,徐岩. 微生物学通报. 2007(06)
博士论文
[1]华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶在异源宿主中的高效分泌表达[D]. 沙冲.江南大学 2015
[2]超声作用下脂肪酶催化豆油水解反应的研究[D]. 刘亚轩.江南大学 2008
[3]华根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶学特性的研究[D]. 王栋.江南大学 2008
硕士论文
[1]米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的表达、酶学特性及其应用研究[D]. 江婷.江南大学 2016
[2]脂肪酶前导肽及N-糖基化对酶在毕赤酵母中分泌表达及酶学特性的影响机制研究[D]. 杨敏.江南大学 2015
[3]华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造[D]. 朱珊珊.江南大学 2012
[4]华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表达和酶学性质研究[D]. 李飏.江南大学 2008
[5]华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究[D]. 王乐乐.江南大学 2008
本文编号：3297767
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同脂肪酶结构示意图
图 2-1 重组质粒 pPIC9K-RCL 构建图谱. 2-1 Construction of cloning plasmid pPIC9K-）：10.00 g 胰蛋白胨，5.00 g 酵母提取物养基时加入 20.00 g 琼脂粉。1L）：20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提固体培养基时加入 20.00 g 琼脂粉。L）：13.40 g YNB，4×10-4g 生物素，20 min。）: 20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提取.0 磷酸钾缓冲液，13.40 g YNB，4×10）: 20.00 g 胰蛋白胨，10.00 g 酵母提取.0 磷酸钾缓冲液，13.40 g YNB，4×1
酶底物结合口袋中氨基酸的亲疏水性以及侧链基团大小等因素可能会影响脂肪酶的底物特异性。因此，根据华根霉脂肪酶（RCL）晶体结构分析和多序列同源比对，针对 RCL 底物结合口袋设计突变位点，从增加口袋亲水性的角度设计三个突变体，包括L285Q、T286Q 以及在序列 H284 和 L285 中间插入一个亲水氨基酸谷氨酰胺 Q，突变体命名为 HQL；从增加空间位阻的角度设计三个突变位点，包括 A116W、I281F 和A116W/I281F。由图 3-1(a)可知，S172、D231 和 H284 为脂肪酶催化三联体，“盖子”结构位于脂肪酶活性中心的上方， A116 位于“盖子”结构上，I281、L285 和 T286 位于底物结合口袋附近。突变后模拟结构如图 3-1(b)所示，盖子结构上 116 位的 A（丙氨酸）突变为 W（色氨酸）后，引入了一个杂环基团；底物结合口袋附近 281 位的 I（异亮氨酸）突变为 F（苯丙氨酸）后，引入了一个苯环基团；这两者均增加了空间位阻。底物结合口袋附近 285 位的 L（亮氨酸）、286 位的 T（苏氨酸）突变为 Q（谷氨酰胺）后，以及在 284 位的 H（组氨酸）与 285 位的 L 之间插入一个 Q 后，均增加了底物结合口袋的亲水性。RCL 氨基酸序列中共有 398 个氨基酸残基，包括 26 个氨基酸的信号肽序列，94 个氨基酸的前导肽序列和 278 个氨基酸的成熟肽序列。图 3-2 为 RCL 氨基酸序列图。
【参考文献】：
期刊论文
[1]毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶（r27RCLC）的糖基化鉴定[J]. 杨敏,喻晓蔚,吴厚军,徐岩. 食品与生物技术学报. 2014(10)
[2]肠道短链脂肪酸产生机制及生理功能的研究进展[J]. 刘松珍,张雁,张名位,孙远明,魏振承. 广东农业科学. 2013(11)
[3]基因拷贝数和甲醇浓度对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的影响[J]. 李飞,喻晓蔚,沙冲,徐岩. 微生物学通报. 2011(03)
[4]工业脂肪酸结晶分离方法概况[J]. 于艳艳,郭莹,陈克云. 科技信息. 2010(28)
[5]华根霉脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究[J]. 王楠,王栋,徐岩,周艺博. 食品工业科技. 2010(02)
[6]超声波对无溶剂体系脂肪酶催化大豆油水解的影响[J]. 黄健花,刘亚轩,金青哲,刘元法,王兴国. 中国油脂. 2009(06)
[7]华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达[J]. 王乐乐,喻晓蔚,徐岩. 高技术通讯. 2009(01)
[8]无溶剂体系中脂肪酶催化大豆油水解反应的研究[J]. 刘亚轩,金青哲,刘元法,王兴国. 中国油脂. 2008(10)
[9]假丝酵母脂肪酶催化底物水解的初步研究[J]. 董恒涛,吴晓英,刘仁春,林影. 现代食品科技. 2008(07)
[10]华根霉胞内脂肪酶同功酶酶学性质研究[J]. 阮振华,王栋,徐岩. 微生物学通报. 2007(06)
博士论文
[1]华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶在异源宿主中的高效分泌表达[D]. 沙冲.江南大学 2015
[2]超声作用下脂肪酶催化豆油水解反应的研究[D]. 刘亚轩.江南大学 2008
[3]华根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶学特性的研究[D]. 王栋.江南大学 2008
硕士论文
[1]米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的表达、酶学特性及其应用研究[D]. 江婷.江南大学 2016
[2]脂肪酶前导肽及N-糖基化对酶在毕赤酵母中分泌表达及酶学特性的影响机制研究[D]. 杨敏.江南大学 2015
[3]华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造[D]. 朱珊珊.江南大学 2012
[4]华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表达和酶学性质研究[D]. 李飏.江南大学 2008
[5]华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究[D]. 王乐乐.江南大学 2008
本文编号：3297767
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