基于phaR/phaP的嗜盐古菌PHA颗粒粒径控制研究与应用
发布时间：2021-07-25 11:34
聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）是多种微生物在碳源过剩、氮源受限时合成的一种天然高分子材料,因其具有材料多变性、热塑性、生物可降解性、生物相容性等特点,在塑料包装、化工、生物医学、农业、生物能源等领域的具有很大的应用前景。目前PHA生产成本高、生产效率低下、发酵中粒径不易控制等原因,限制了天然PHA颗粒的研发与应用。因此,低成本的粒径可控的天然PHA颗粒的生产和加工是目前研究的热点。本课题基于前期成功鉴定的嗜盐古菌Haloferax mediterranei中PHA结合的结构蛋白PhaP和PHA调控蛋白PhaR,通过调整PhaP或PhaR等PHA颗粒相关蛋白表达量,或更换PHA生产的背景菌株等方法,影响PHA颗粒的粒径,并总结出一套PHA颗粒粒径控制策略:在PhaP蛋白高量过表达的H.mediterraneiDF50::pWLoxP、H.mediterraneiΔphaRP::pWLoxP及H.mediterraneiΔphaRP::pWLexP组中,主要生产100nm以下的小粒径PHA颗粒;在PhaP中度过表达的H.mediterraneiDF50...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PHA分子结构通式
13第2章材料与方法2.1相关材料2.1.1菌种本研究选择TIANGEN公司的大肠杆菌E.coliTOP10用于分子克拢H.mediterraneiCGMCC1.2087为本研究采用的野生型地中海富盐菌菌株，H.mediterraneiDF50为基于野生型地中海富盐菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株，H.mediterraneiΔphaRP为基于H.mediterraneiDF50的phaR&phaP双敲除株。2.1.2质粒本研究选择pWL502质粒作为载体，质粒图谱如图2.1所示。本课题选用pWL502质粒作为分子克隆操作的载体，pWL502质粒是一种穿梭质粒，不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在嗜盐古菌中扩增和表达。图2.1pWL502质粒图谱pWL502质粒全长约7.9kb，含有多种复制起始位点，pWL502质粒含有BamHⅠ、KpnⅠ等多种限制性酶切位点，可进行酶切，连接来插入外源DNA片段。pWL502质粒含有氨苄青霉素抗性基因，含pWL502质粒的大肠杆菌可在含
19（66bp）片段，在设计引物时，在两种启动子的上游引入酶切位点KpnⅠ，下游引入酶切位点HindⅢ。图2.2pWLexP质粒构建示意图为获得片段gfp（726），我们以质粒pWLGFP为模板，经PCR扩增得到，并在设计引物时，在片段上游引入酶切位点HindⅢ，下游引入酶切位点BamHⅠ。为获得片段phaP(468bp)，我们同样以H.mediterraneiATCC33500裂解液作模板，经过PCR扩增得到，并在设计引物时，在phaP上游引入酶切位点HindⅢ，下游引入酶切位点BamHⅠ。为获得片段ex-Pro-gfp和片段ox-Pro-gfp，将片段ex-Pro、ox-Pro和gfp经HindⅢ酶切孵育后，经T4DNA连接酶连接即分别得到片段ex-Pro-gfp(894bp)和ox-Pro-gfp(792bp)。为获得片段ex-Pro-phaP和片段ox-Pro-phaP，将片段ex-Pro、ox-Pro和phaP经HindⅢ酶切孵育后，经T4DNA连接酶连接即分别得到片段ex-Pro-phaP(636bp)和ox-Pro-phaP(534bp)。由于H.mediterranei的基因组内，启动子WTpRF（后66bp即为启动子D41）和phaR片段直接相连，因此片段ex-pro-phaR(489bp)和片段ox-pro-phaR(387bp)可直接以H.mediterranei裂解液为模板经pcr得到。在设计引物时，在片段首尾分别添加酶切位点KpnⅠ和酶切位点BamHⅠ。
【参考文献】：
期刊论文
[1]两株嗜盐古菌所产C50类胡萝卜素的鉴定及抗氧化活性[J]. 侯靖,吕布,崔恒林. 中国食品学报. 2019(10)
[2]低成本合成聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的研究进展[J]. 邱石正,李佳益,杨景辰,刘长莉. 生物技术通报. 2019(09)
[3]重组蛋白纯化研究进展[J]. 蒋世强,潘能庆,鄢航,贾银海,苏惠梅,蒋和生,杨秀荣. 现代农业科技. 2017(04)
[4]微塑料:海洋鱼类的“致命杀手”[J]. 倪伟波. 科学新闻. 2016(08)
[5]聚羟基脂肪酸酯的研究进展[J]. 尹进,车雪梅,陈国强. 生物工程学报. 2016(06)
[6]世界海洋环境中的塑料污染现状分析及治理建议[J]. 廖琴,曲建升,王金平,高峰. 世界科技研究与发展. 2015(02)
[7]基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统[J]. 伍锦花,蔡双凤,刘海龙,侯靖,韩静,周坚,向华. 微生物学报. 2014(09)
[8]生物材料PHA的发酵与提取工艺改进[J]. 王蕊. 生物技术世界. 2012(04)
[9]我国聚羟基脂肪酸酯产业链的发展概况[J]. 魏晓星,李正军,陈国强. 高分子通报. 2011(04)
[10]生物高分子材料聚羟基脂肪酸酯（PHA）开发现状及产业化前景分析[J]. 陈国强. 化工新型材料. 2010(10)
博士论文
[1]PHA颗粒结合蛋白的表达、结晶与X射线衍射分析[D]. 赵明莲.清华大学 2005
[2]中国石油化工产业[D]. 江建华.中国社会科学院研究生院 2001
硕士论文
[1]3-羟基丁酸甲酯作为新型汽油添加剂的性能研究[D]. 王珍.汕头大学 2010
[2]聚羟基脂肪酸酯的应用—3-羟基脂肪酸甲酯作用燃料的潜能开发[D]. 罗容聪.汕头大学 2008
本文编号：3301952
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PHA分子结构通式
13第2章材料与方法2.1相关材料2.1.1菌种本研究选择TIANGEN公司的大肠杆菌E.coliTOP10用于分子克拢H.mediterraneiCGMCC1.2087为本研究采用的野生型地中海富盐菌菌株，H.mediterraneiDF50为基于野生型地中海富盐菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株，H.mediterraneiΔphaRP为基于H.mediterraneiDF50的phaR&phaP双敲除株。2.1.2质粒本研究选择pWL502质粒作为载体，质粒图谱如图2.1所示。本课题选用pWL502质粒作为分子克隆操作的载体，pWL502质粒是一种穿梭质粒，不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在嗜盐古菌中扩增和表达。图2.1pWL502质粒图谱pWL502质粒全长约7.9kb，含有多种复制起始位点，pWL502质粒含有BamHⅠ、KpnⅠ等多种限制性酶切位点，可进行酶切，连接来插入外源DNA片段。pWL502质粒含有氨苄青霉素抗性基因，含pWL502质粒的大肠杆菌可在含
19（66bp）片段，在设计引物时，在两种启动子的上游引入酶切位点KpnⅠ，下游引入酶切位点HindⅢ。图2.2pWLexP质粒构建示意图为获得片段gfp（726），我们以质粒pWLGFP为模板，经PCR扩增得到，并在设计引物时，在片段上游引入酶切位点HindⅢ，下游引入酶切位点BamHⅠ。为获得片段phaP(468bp)，我们同样以H.mediterraneiATCC33500裂解液作模板，经过PCR扩增得到，并在设计引物时，在phaP上游引入酶切位点HindⅢ，下游引入酶切位点BamHⅠ。为获得片段ex-Pro-gfp和片段ox-Pro-gfp，将片段ex-Pro、ox-Pro和gfp经HindⅢ酶切孵育后，经T4DNA连接酶连接即分别得到片段ex-Pro-gfp(894bp)和ox-Pro-gfp(792bp)。为获得片段ex-Pro-phaP和片段ox-Pro-phaP，将片段ex-Pro、ox-Pro和phaP经HindⅢ酶切孵育后，经T4DNA连接酶连接即分别得到片段ex-Pro-phaP(636bp)和ox-Pro-phaP(534bp)。由于H.mediterranei的基因组内，启动子WTpRF（后66bp即为启动子D41）和phaR片段直接相连，因此片段ex-pro-phaR(489bp)和片段ox-pro-phaR(387bp)可直接以H.mediterranei裂解液为模板经pcr得到。在设计引物时，在片段首尾分别添加酶切位点KpnⅠ和酶切位点BamHⅠ。
【参考文献】：
期刊论文
[1]两株嗜盐古菌所产C50类胡萝卜素的鉴定及抗氧化活性[J]. 侯靖,吕布,崔恒林. 中国食品学报. 2019(10)
[2]低成本合成聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的研究进展[J]. 邱石正,李佳益,杨景辰,刘长莉. 生物技术通报. 2019(09)
[3]重组蛋白纯化研究进展[J]. 蒋世强,潘能庆,鄢航,贾银海,苏惠梅,蒋和生,杨秀荣. 现代农业科技. 2017(04)
[4]微塑料:海洋鱼类的“致命杀手”[J]. 倪伟波. 科学新闻. 2016(08)
[5]聚羟基脂肪酸酯的研究进展[J]. 尹进,车雪梅,陈国强. 生物工程学报. 2016(06)
[6]世界海洋环境中的塑料污染现状分析及治理建议[J]. 廖琴,曲建升,王金平,高峰. 世界科技研究与发展. 2015(02)
[7]基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统[J]. 伍锦花,蔡双凤,刘海龙,侯靖,韩静,周坚,向华. 微生物学报. 2014(09)
[8]生物材料PHA的发酵与提取工艺改进[J]. 王蕊. 生物技术世界. 2012(04)
[9]我国聚羟基脂肪酸酯产业链的发展概况[J]. 魏晓星,李正军,陈国强. 高分子通报. 2011(04)
[10]生物高分子材料聚羟基脂肪酸酯（PHA）开发现状及产业化前景分析[J]. 陈国强. 化工新型材料. 2010(10)
博士论文
[1]PHA颗粒结合蛋白的表达、结晶与X射线衍射分析[D]. 赵明莲.清华大学 2005
[2]中国石油化工产业[D]. 江建华.中国社会科学院研究生院 2001
硕士论文
[1]3-羟基丁酸甲酯作为新型汽油添加剂的性能研究[D]. 王珍.汕头大学 2010
[2]聚羟基脂肪酸酯的应用—3-羟基脂肪酸甲酯作用燃料的潜能开发[D]. 罗容聪.汕头大学 2008
本文编号：3301952
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