高效生产纤维素酶的重组酿酒酵母菌株构建

发布时间：2022-01-08 19:25

　　酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可作为宿主生产多种药用蛋白和工业酶等,近年来作为异源蛋白生产的宿主被广泛研究。然而,由于酿酒酵母蛋白生产和分泌水平较低,限制了其实际应用。酿酒酵母蛋白生产需要多基因协同作用,过量生产蛋白可能导致代谢胁迫,但对重组酵母蛋白生产的全局调控机制研究还不够深入。本课题组前期在利用环境胁迫耐性关键基因改造酿酒酵母菌株的研究过程中,发现膜蛋白Mdg1p和与维持基因组稳定性相关的蛋白Mhf1p在乙酸耐性提高的重组酵母中表达显著上调。目前对这两个蛋白的功能研究较少,其对异源蛋白生产的作用还不清楚。本研究利用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,在分泌表达纤维二糖水解酶（CBH）、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株中分别过表达MDG1和MHF1基因,并对所获得的重组酵母菌株产酶能力进行评价,进而初步探讨了其作用机理。结果表明,分别过表达这两个基因后均提高了重组酵母CBH的活性。此外,MDG1的过表达还提高了胞外内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性。利用实时定量PCR对蛋白分泌途径相关基因的转录水平进行分析,结果表明,所获得的重组酵... 

【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 绪论
    1.1 木质纤维素生物转化及纤维素酶
        1.1.1 木质纤维素生物转化及纤维素酶
        1.1.2 纤维素酶的组成、分类及功能
    1.2 异源蛋白在酿酒酵母中的表达和分泌
        1.2.1 酿酒酵母蛋白分泌途径
        1.2.2 异源蛋白在酿酒酵母中的表达研究及其优化策略
    1.3 本课题研究涉及的靶点基因
        1.3.1 MDG1基因功能相关研究
        1.3.2 MHF1基因功能相关研究
    1.4 本研究的目的意义和技术路线
2 MDG1基因过表达对重组酵母分泌纤维素酶的影响
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验相关仪器设备
        2.2.2 实验菌株
        2.2.3 实验相关试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 过表达载体的构建
        2.3.2 过表达菌株的构建与活化
        2.3.3 菌株酶活评价
        2.3.4 RNA提取及实时定量分析
        2.3.5 细胞膜透性评价方法
        2.3.6 细胞壁完整性评价方法
        2.3.7 细胞形态观察
        2.3.8 总麦角甾醇含量的测定
        2.3.9 SDS-PAGE分析
        2.3.10 耐性平板比较实验
    2.4 实验结果
        2.4.1 MDG1过表达菌株构建
        2.4.2 MDG1过表达提高了酿酒酵母中纤维素酶的产量
        2.4.3 MDG1过表达影响参与分泌途径相关基因的表达
        2.4.4 MDG1过表达改变了宿主细胞的形态
        2.4.5 MDG1过表达改变了质膜和细胞壁的特性
        2.4.6 MDG1过表达菌株内质网胁迫应答表征
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
3 MHF1基因过表达对重组酵母分泌纤维素酶的影响
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验相关仪器设备
        3.2.2 实验菌株
        3.2.3 实验相关试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 菌株构建与活化
        3.3.2 菌株酶活评价
        3.3.3 RNA提取及实时定量分析
        3.3.4 SDS-PAGE分析
        3.3.5 胞内活性氧水平检测
    3.4 实验结果
        3.4.1 MHF1过表达菌株构建
        3.4.2 MHF1过表达对重组酵母菌株酶活的影响
        3.4.3 MHF1过表达对重组酵母胞内活性氧水平的影响
        3.4.4 MHF1过表达对重组酵母关键基因转录的影响
        3.4.5 MHF1过表达菌株内质网胁迫应答表征
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
结论
创新点
展望
参考文献
附录A 本论文涉及的基因序列
附表：本文使用主要引物序列
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]过表达MRP8提高酿酒酵母乙酸耐性及乙醇发酵效率[J]. 万春,万青青,熊亮,赵心清,白凤武.  生物加工过程. 2017(05)
[2]基于纤维小体展示技术的酿酒酵母纤维素乙醇研究进展[J]. 范立海,谭天伟.  中国科学:化学. 2014(01)
[3]锌离子提高絮凝酵母乙酸胁迫耐受性[J]. 徐桂红,赵心清,李宁,白凤武.  化工学报. 2012(06)



本文编号：3577139