热休克蛋白70在铁依赖的氧化应激中的作用和机制
发布时间：2022-01-08 19:20
铁依赖的氧化应激是指细胞中的铁离子催化芬顿（Fenton）反应,造成脂质过氧化物积累、蛋白质变性和错误折叠的现象。热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）属于应激蛋白,可在细胞氧化应激状态下帮助错误折叠蛋白重新折叠或降解保护细胞。然而,HSP70和铁依赖的氧化应激的关系尚不明确。多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid,PUFA）是人体必需脂肪酸,膳食摄入的PUFA在铁离子存在的情况下也会发生脂质过氧化,细胞病理条件下会造成脂质过氧化物积累。本研究主要探究在二十二碳六烯酸n-3系列多不饱和脂肪酸（Docosahexaenoic acid,DHA）叠加铁死亡诱导剂erastin和RSL3诱导的PC3细胞的铁依赖的氧化应激模型中,HSP70家族中HSPA1A、HSPA8及HSPA9的作用以及可能的机制,从而为将铁依赖的氧化应激机制应用于癌症治疗和神经退行性等疾病的预防提供理论依据。主要结论如下:（1）通过构建质粒在胞内过表达HSPA1A、HSPA8和HSPA9以及构建小干扰RNA敲减HSPA8、HSPA9,采用MTT法测定细胞存活...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DHA加剧erastin和RSL3诱导的细胞死亡Figure1DHAexacerbateserastinandRSL3inducedcelldeath
3结果与讨论17图2HSP70抑制剂VER155008对铁依赖的氧化应激的影响Figure2EffectofHSP70inhibitorVER155008iniron-dependentoxidativestress3.1.2过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激中的作用已经有报道表明HSP70家族中HSPA5蛋白对erastin诱导的PDAC细胞死亡有保护作用，这与我们HSP70抑制剂结果一致，但是也有文献报道HSPA8在erastin诱导的HT22细胞死亡中起抑制作用[84]，这我们的结论不同，需要进一步探究，因此本实验主要探究HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激的作用。构建HSPA1A、HSPA8、HSPA9过表达质粒。载体选择实验室已有载体pEB，载体中含有GFP标签，GFP为非融合表达，在NCBI网站设计得到HSPA1A全长引物（RLQ78993.1），HSPA8全长引物（AOF45639.1），HSPA9全长引物（RLQ73870.1），使用高保真酶PCR扩增HSPA1A、HSPA8、HSPA9片段，pEB载体双酶切，转化，挑单克隆摇菌提质粒测序。测序正确以后，扩大培养提取质粒。质粒提取后，转染进入细胞，24h后提取细胞进行WesternBlot。结果如图3，说明质粒能够在细胞中表达目的蛋白，可用于铁依赖的氧化应激模型中进行功能验证。图3过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9蛋白的验证Figure3ValidationofoverexpressedHSPA1A、HSPA8、HSPA9proteins在96孔板中按1000个细胞/孔接入相应细胞，12~24h内完成转染，转染24~48h以后通过荧光判断转染效率，用1%FBS的培养基中加入对应刺激，PC3用250nMRSL3+15μMDHA或者5μMerastin+15μMDHA诱导细胞发生铁依赖的氧化应激。
3结果与讨论17图2HSP70抑制剂VER155008对铁依赖的氧化应激的影响Figure2EffectofHSP70inhibitorVER155008iniron-dependentoxidativestress3.1.2过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激中的作用已经有报道表明HSP70家族中HSPA5蛋白对erastin诱导的PDAC细胞死亡有保护作用，这与我们HSP70抑制剂结果一致，但是也有文献报道HSPA8在erastin诱导的HT22细胞死亡中起抑制作用[84]，这我们的结论不同，需要进一步探究，因此本实验主要探究HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激的作用。构建HSPA1A、HSPA8、HSPA9过表达质粒。载体选择实验室已有载体pEB，载体中含有GFP标签，GFP为非融合表达，在NCBI网站设计得到HSPA1A全长引物（RLQ78993.1），HSPA8全长引物（AOF45639.1），HSPA9全长引物（RLQ73870.1），使用高保真酶PCR扩增HSPA1A、HSPA8、HSPA9片段，pEB载体双酶切，转化，挑单克隆摇菌提质粒测序。测序正确以后，扩大培养提取质粒。质粒提取后，转染进入细胞，24h后提取细胞进行WesternBlot。结果如图3，说明质粒能够在细胞中表达目的蛋白，可用于铁依赖的氧化应激模型中进行功能验证。图3过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9蛋白的验证Figure3ValidationofoverexpressedHSPA1A、HSPA8、HSPA9proteins在96孔板中按1000个细胞/孔接入相应细胞，12~24h内完成转染，转染24~48h以后通过荧光判断转染效率，用1%FBS的培养基中加入对应刺激，PC3用250nMRSL3+15μMDHA或者5μMerastin+15μMDHA诱导细胞发生铁依赖的氧化应激。
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酰胺诱导热休克蛋白70在缺氧性肺动脉高压新生大鼠中的保护作用研究[J]. 赵婷,王彦梅,王乐. 新疆医科大学学报. 2019(12)
[2]铁死亡的途径与亨廷顿舞蹈症的关系[J]. 李洁,李欣,蒋如如,蔡小玲,哈小琴. 基础医学与临床. 2019(11)
[3]程序性细胞死亡形式研究进展[J]. 胡艳红,张凡,张楚焌,孙天石,蕫一昕,李卫红. 辽宁中医药大学学报. 2018(12)
[4]铁死亡发生机制的研究进展[J]. 周文博,孔晨飞,秦高伟,王媛媛,刘新,王晓峰. 生物化学与生物物理进展. 2018(01)
[5]铁死亡的机制及其在神经疾病中的作用[J]. 姜懿纳,阳松威,张欣,罗林明,张钊,陈乃宏. 中国药理学通报. 2018(02)
[6]急性肾损伤相关细胞学机制的新进展[J]. 梁馨苓. 中国血液净化. 2017(01)
[7]细胞死亡方式及其清除[J]. 崔天盆,郑承红,陈杰,苏斌涛. 中国免疫学杂志. 2014(06)
[8]人肿瘤细胞悬液裸鼠皮下接种及影响移植成功的因素[J]. 田庆锷,李玛琳. 实验动物科学与管理. 2004(03)
硕士论文
[1]小细胞肺癌多因素预后分析及预后模型的建立[D]. 郭寒菲.吉林大学 2019
[2]单不饱和脂肪酸在铁死亡中的作用以及机制的研究[D]. 付国玲.江南大学 2018
本文编号：3577132
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DHA加剧erastin和RSL3诱导的细胞死亡Figure1DHAexacerbateserastinandRSL3inducedcelldeath
3结果与讨论17图2HSP70抑制剂VER155008对铁依赖的氧化应激的影响Figure2EffectofHSP70inhibitorVER155008iniron-dependentoxidativestress3.1.2过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激中的作用已经有报道表明HSP70家族中HSPA5蛋白对erastin诱导的PDAC细胞死亡有保护作用，这与我们HSP70抑制剂结果一致，但是也有文献报道HSPA8在erastin诱导的HT22细胞死亡中起抑制作用[84]，这我们的结论不同，需要进一步探究，因此本实验主要探究HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激的作用。构建HSPA1A、HSPA8、HSPA9过表达质粒。载体选择实验室已有载体pEB，载体中含有GFP标签，GFP为非融合表达，在NCBI网站设计得到HSPA1A全长引物（RLQ78993.1），HSPA8全长引物（AOF45639.1），HSPA9全长引物（RLQ73870.1），使用高保真酶PCR扩增HSPA1A、HSPA8、HSPA9片段，pEB载体双酶切，转化，挑单克隆摇菌提质粒测序。测序正确以后，扩大培养提取质粒。质粒提取后，转染进入细胞，24h后提取细胞进行WesternBlot。结果如图3，说明质粒能够在细胞中表达目的蛋白，可用于铁依赖的氧化应激模型中进行功能验证。图3过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9蛋白的验证Figure3ValidationofoverexpressedHSPA1A、HSPA8、HSPA9proteins在96孔板中按1000个细胞/孔接入相应细胞，12~24h内完成转染，转染24~48h以后通过荧光判断转染效率，用1%FBS的培养基中加入对应刺激，PC3用250nMRSL3+15μMDHA或者5μMerastin+15μMDHA诱导细胞发生铁依赖的氧化应激。
3结果与讨论17图2HSP70抑制剂VER155008对铁依赖的氧化应激的影响Figure2EffectofHSP70inhibitorVER155008iniron-dependentoxidativestress3.1.2过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激中的作用已经有报道表明HSP70家族中HSPA5蛋白对erastin诱导的PDAC细胞死亡有保护作用，这与我们HSP70抑制剂结果一致，但是也有文献报道HSPA8在erastin诱导的HT22细胞死亡中起抑制作用[84]，这我们的结论不同，需要进一步探究，因此本实验主要探究HSPA1A、HSPA8、HSPA9对铁依赖的氧化应激的作用。构建HSPA1A、HSPA8、HSPA9过表达质粒。载体选择实验室已有载体pEB，载体中含有GFP标签，GFP为非融合表达，在NCBI网站设计得到HSPA1A全长引物（RLQ78993.1），HSPA8全长引物（AOF45639.1），HSPA9全长引物（RLQ73870.1），使用高保真酶PCR扩增HSPA1A、HSPA8、HSPA9片段，pEB载体双酶切，转化，挑单克隆摇菌提质粒测序。测序正确以后，扩大培养提取质粒。质粒提取后，转染进入细胞，24h后提取细胞进行WesternBlot。结果如图3，说明质粒能够在细胞中表达目的蛋白，可用于铁依赖的氧化应激模型中进行功能验证。图3过表达HSPA1A、HSPA8、HSPA9蛋白的验证Figure3ValidationofoverexpressedHSPA1A、HSPA8、HSPA9proteins在96孔板中按1000个细胞/孔接入相应细胞，12~24h内完成转染，转染24~48h以后通过荧光判断转染效率，用1%FBS的培养基中加入对应刺激，PC3用250nMRSL3+15μMDHA或者5μMerastin+15μMDHA诱导细胞发生铁依赖的氧化应激。
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酰胺诱导热休克蛋白70在缺氧性肺动脉高压新生大鼠中的保护作用研究[J]. 赵婷,王彦梅,王乐. 新疆医科大学学报. 2019(12)
[2]铁死亡的途径与亨廷顿舞蹈症的关系[J]. 李洁,李欣,蒋如如,蔡小玲,哈小琴. 基础医学与临床. 2019(11)
[3]程序性细胞死亡形式研究进展[J]. 胡艳红,张凡,张楚焌,孙天石,蕫一昕,李卫红. 辽宁中医药大学学报. 2018(12)
[4]铁死亡发生机制的研究进展[J]. 周文博,孔晨飞,秦高伟,王媛媛,刘新,王晓峰. 生物化学与生物物理进展. 2018(01)
[5]铁死亡的机制及其在神经疾病中的作用[J]. 姜懿纳,阳松威,张欣,罗林明,张钊,陈乃宏. 中国药理学通报. 2018(02)
[6]急性肾损伤相关细胞学机制的新进展[J]. 梁馨苓. 中国血液净化. 2017(01)
[7]细胞死亡方式及其清除[J]. 崔天盆,郑承红,陈杰,苏斌涛. 中国免疫学杂志. 2014(06)
[8]人肿瘤细胞悬液裸鼠皮下接种及影响移植成功的因素[J]. 田庆锷,李玛琳. 实验动物科学与管理. 2004(03)
硕士论文
[1]小细胞肺癌多因素预后分析及预后模型的建立[D]. 郭寒菲.吉林大学 2019
[2]单不饱和脂肪酸在铁死亡中的作用以及机制的研究[D]. 付国玲.江南大学 2018
本文编号：3577132
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