(S)-羰基还原酶Ⅱ以木聚糖为辅助底物高效催化合成（S）-苯乙二醇
发布时间：2022-01-09 05:16
来自近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M203011的（S）-羰基还原酶Ⅱ（SCRⅡ）能催化2-羟基苯乙酮（HAP）,合成（S）-苯乙二醇（PED）,但反应需要烟酰胺类辅酶NADPH的参与。由于辅酶价格较高、稳定性差、难以重复利用,导致手性催化合成成本较高,限制了其在手性催化中的应用。本研究运用重叠延伸PCR技术,构建了SCRⅡ、葡萄糖脱氢酶突变体Ala258Phe/GDH和木聚糖酶XYN2三个酶的共表达和融合表达体系,以实现辅酶循环的高效手性合成。两种重组菌以2-羟基苯乙酮为底物,木聚糖为辅助底物,高效合成（S）-苯乙二醇,本研究成功将木聚糖代谢介导的辅酶再生体系引入手性合成中,为木聚糖作辅助底物促进氧化还原酶介导的手性催化奠定了研究基础。具体研究内容如下:（1）以pET-SCRⅡ、pET-A258F/GDH、pET-XYN2为模板,利用重叠延伸PCR方法,将SCRⅡ、A258F/GDH和XYN2基因分别通过SD-AS、GGGGS序列连接,构建了pET-S-SD-AS-G-SD-AS-2、pET-S-SD-AS-2-SD-AS-G、pET-G-SD...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
羰基还原酶不对称还原催化机理Fig.1-1Asymmetricreductionmechanismofcarbonylreductase
第二章材料与方法11图1-2多酶偶联体系催化(S)-苯乙二醇的生物合成途径Fig.1-2Thebiosyntheticpathwayof(S)-PEDthroughamulti-enzymecoupledsystem
江南大学硕士学位论文20第三章结果与讨论3.1构建SCRII、A258F/GDH和XYN2共表达和融合表达菌株3.1.1多基因共表达体系的构建以载体pET-SCRII、pET-A258F/GDH和pET-XYN2为基因模板，以设计好的带有SD-ASlinker的两端引物，进行PCR，扩增出带有SD-ASlinker的共表达基因序列的三个单基因片段，经退火重叠连接后延伸为完整双链；然后以获得的三个完整DNA双链为模板，以首尾基因片段的引物，采用重叠延伸PCR进行扩增，获得共表达基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S，电泳验证结果如图3-1。图3-1重组共表达质粒PCR验证Fig.3-1Identificationofrecombinantco-expressionplasmidsbyPCRamplification注：MDNAmarker,1S-SD-AS-G-SD-AS-2,2S-SD-AS-2-SD-AS-G,3G-SD-AS-S-SD-AS-2,4G-SD-AS-2-SD-AS-S利用限制性内切酶BamHI和SacI分别对PCR共表达基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S及表达载体pET-28a进行双酶酶切反应，酶切产物采用胶回收、柱纯化进行提纯，载体pET-28a与共表达基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S以T4DNA连接酶，金属浴16℃条件下连接16h，转化克隆菌株E.coliJM109感受态细胞，经卡那霉素抗性LB平板筛选，提取质粒测序验证，测序结果比对一致，共表达重组质粒构建成功，质粒转化表达菌株E.coliBL21（DE3），获得4种重组共表达大肠杆菌菌株E.coli/pET-S-SD-AS-G-SD-AS-2、E.coli/pET-S-SD-AS-2-SD-AS-G、E.coli/pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2、E.coli/pET-G-SD-AS-2-SD-AS-S。共表达菌株的构建流程如图3-2所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]阿瑞匹坦有关物质的合成[J]. 王祖元,霍彩霞,郑志兵. 国际药学研究杂志. 2017(07)
[2]教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因xynA原核表达及诱导产酶优化[J]. 熊科,崔晓亭,高乐,李秀婷. 中国调味品. 2016(09)
[3]耐热木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表达及应用[J]. 沈艺红,薛业敏,侯静静,许家兴,李相前. 食品科学. 2015(01)
[4](R)-、（S）-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位[J]. 张荣珍,徐岩,王珊珊,张波涛,耿亚维. 微生物学报. 2011(06)
[5]手性2-氨基-1-苯基乙醇类化合物的不对称合成研究进展[J]. 赵圣印. 有机化学. 2007(11)
博士论文
[1]生物催化法还原酮酯和羧酸的研究[D]. 倪燕.华东理工大学 2013
硕士论文
[1]Sortase A介导的羰基还原酶寡聚体热稳定性加强及高效转化手性醇[D]. 李坤鹏.江南大学 2017
本文编号：3578036
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
羰基还原酶不对称还原催化机理Fig.1-1Asymmetricreductionmechanismofcarbonylreductase
第二章材料与方法11图1-2多酶偶联体系催化(S)-苯乙二醇的生物合成途径Fig.1-2Thebiosyntheticpathwayof(S)-PEDthroughamulti-enzymecoupledsystem
江南大学硕士学位论文20第三章结果与讨论3.1构建SCRII、A258F/GDH和XYN2共表达和融合表达菌株3.1.1多基因共表达体系的构建以载体pET-SCRII、pET-A258F/GDH和pET-XYN2为基因模板，以设计好的带有SD-ASlinker的两端引物，进行PCR，扩增出带有SD-ASlinker的共表达基因序列的三个单基因片段，经退火重叠连接后延伸为完整双链；然后以获得的三个完整DNA双链为模板，以首尾基因片段的引物，采用重叠延伸PCR进行扩增，获得共表达基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S，电泳验证结果如图3-1。图3-1重组共表达质粒PCR验证Fig.3-1Identificationofrecombinantco-expressionplasmidsbyPCRamplification注：MDNAmarker,1S-SD-AS-G-SD-AS-2,2S-SD-AS-2-SD-AS-G,3G-SD-AS-S-SD-AS-2,4G-SD-AS-2-SD-AS-S利用限制性内切酶BamHI和SacI分别对PCR共表达基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S及表达载体pET-28a进行双酶酶切反应，酶切产物采用胶回收、柱纯化进行提纯，载体pET-28a与共表达基因片段S-SD-AS-G-SD-AS-2、S-SD-AS-2-SD-AS-G、G-SD-AS-S-SD-AS-2和G-SD-AS-2-SD-AS-S以T4DNA连接酶，金属浴16℃条件下连接16h，转化克隆菌株E.coliJM109感受态细胞，经卡那霉素抗性LB平板筛选，提取质粒测序验证，测序结果比对一致，共表达重组质粒构建成功，质粒转化表达菌株E.coliBL21（DE3），获得4种重组共表达大肠杆菌菌株E.coli/pET-S-SD-AS-G-SD-AS-2、E.coli/pET-S-SD-AS-2-SD-AS-G、E.coli/pET-G-SD-AS-S-SD-AS-2、E.coli/pET-G-SD-AS-2-SD-AS-S。共表达菌株的构建流程如图3-2所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]阿瑞匹坦有关物质的合成[J]. 王祖元,霍彩霞,郑志兵. 国际药学研究杂志. 2017(07)
[2]教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因xynA原核表达及诱导产酶优化[J]. 熊科,崔晓亭,高乐,李秀婷. 中国调味品. 2016(09)
[3]耐热木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表达及应用[J]. 沈艺红,薛业敏,侯静静,许家兴,李相前. 食品科学. 2015(01)
[4](R)-、（S）-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位[J]. 张荣珍,徐岩,王珊珊,张波涛,耿亚维. 微生物学报. 2011(06)
[5]手性2-氨基-1-苯基乙醇类化合物的不对称合成研究进展[J]. 赵圣印. 有机化学. 2007(11)
博士论文
[1]生物催化法还原酮酯和羧酸的研究[D]. 倪燕.华东理工大学 2013
硕士论文
[1]Sortase A介导的羰基还原酶寡聚体热稳定性加强及高效转化手性醇[D]. 李坤鹏.江南大学 2017
本文编号：3578036
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