重组德谷胰岛素前体蛋白的表达、发酵工艺优化和放大

发布时间：2022-01-14 11:35

　　基础胰岛素及类似药物的临床应用使糖尿病患者整体血糖得到了有效的控制。但因其作用时间短、稳定性差,以及依从性差等问题,促使研究者去开发一种作用平稳而持久、体内药效变异性小,副作用更小的新型胰岛素。德谷胰岛素即为这类新型胰岛素中的一种。本论文旨在构建重组德谷胰岛素前体蛋白的表达系统,并着重将其发酵工艺从实验室规模放大到中试规模,为实现德谷胰岛素的工业化生产打下基础。将人工合成的人胰岛素前体基因INS和HS631质粒连接为重组质粒HS631-INS,并转入大肠杆菌BL21（DE3）内,构建了稳定表达德谷胰岛素前体蛋白的重组工程菌HS631-INS/BL21。酶切图谱和测序结果显示:表达载体和前体基因大小及序列均与理论一致。前体蛋白经多步纯化得到了重组德谷胰岛素样品。质谱分析表明其分子量与德谷胰岛素理论值一致,均为5826Da。经胰岛素生物测定法检测,产物的效价为26.38IU/mg,有良好的生物学活性。在摇瓶实验中,初步比较分析了不同培养基及碳源、氮源、碳氮比和无机盐等对重组菌的菌体密度和德谷胰岛素前体蛋白表达量的影响。筛选出最适的培养基配方:葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵1.Og... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．１?ＩＮＳ片段胶回收鉴定图谱??

图２．２设计与检测序列比对结果??２Ａ２?

转化进入大肠杆菌ＢＬ２１宿主细胞内。经过Ｔｅｔ抗性ＬＢ平板筛选，挑取单菌落培养，质??粒抽提后用Ｉ和你／?ＩＩ酶切。酶切产物经ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳分析，在约６７０ｂｐ??处可见目的基因条带，该片段中包括３４５ｂｐ的目的基因。见图２．３，说明插入结果正确。??Ｈ漏ｂｐ??ＳＯＯＯｂｐ??２０００ｂ??ｌＯＯＯｂｐ??７５０ｂＰ??：??图２．３?ＨＳ６３１－ＩＮＳ重组质粒酶切鉴定图谱??Ｍ：?ＤＬ５０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?（ｂｐ）；?１￣６：?６?个质粒?ＥｃｏＲ?１?和?Ｂｇｌ?丨丨双酶切结果??ＦＳｅ．Ｉ５＿ＨＤ２５１?－］２２：．ＸＹ＾Ｉ６ＵＰ．ＵＵ．１２Ｄ？ｊｂｌ?ＲｕｎＳｕ．－？ｄ?Ｆｅ３：Ｓ．?２ＤＩ２．￥ｉ｝ｌ：３０?Ｓ？ｇｍｌ?＼３６?ＴＪ５５ＣＪＣ２??Ｓｕｎｐｉｅ?ＯＳＨ?ｌ２｛Ｑ３＊ｒ＜Ｓ＊Ａ＞Ａ?Ｌｕｅ?！＇?Ｄｕｅ?ｔｐＫｉ〇｜?１５５６?１０３６?ｂｕｎ?ｉｎ?１６３０３?ｋｕｉ?Ｆｉ｜ｔ?Ｉ?ｏｆ?３??￣?ｉｌ?Ｈ?５５?１３￣?￣￣?５?ｉｓ?

【参考文献】：
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本文编号：3588433