结冷胶生产菌株代谢工程改造

发布时间：2022-02-22 08:06

　　少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas elodea JLJ）发酵产生的结冷胶（gellan gum）是一种高分子线性阴离子型胞外荚膜多糖。其具有良好的耐热性、耐酸碱性、无毒无害等性能,广泛应用于各种领域。在结冷胶发酵生产过程中,随着结冷胶的积累,发酵液会变得越发粘稠,因此其发酵过程中的溶氧供需矛盾一直是一个亟待解决的严峻问题。本研究拟采用CRISPR/Cas9技术将透明颤菌血红蛋白（vgb）基因敲入少动鞘氨醇单胞菌细胞内改造其代谢网络,从而提高菌株摄取和利用氧的能力,解决结冷胶发酵过程中氧的供需矛盾,有效提高结冷胶产量;对重组菌株的发酵培养基和发酵条件进行改造,最终使得结冷胶的产量得到显著提高。主要研究结果为:（1）通过PCR法扩增获得乙酰基转移酶基因（nat）片段,确定菌株JLJ基因组中存在nat基因,选定其为靶位点。（2）通过CRISPR/Cas9技术对菌株JLJ进行改造,将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）敲入基因组中,并将nat基因敲除,获得重组菌株JLJ-vgb。PCR、SDS-PAGE以及CO差光谱分析均表明vgb基因已成功敲入菌株JLJ基因组中,并成功表达有活性的血红蛋... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 结冷胶研究进展
        1.1 少动鞘氨醇单胞菌
        1.2 结冷胶
            1.2.1 概述
            1.2.2 结冷胶的结构
            1.2.3 结冷胶的理化性质
            1.2.4 结冷胶的体内合成过程
            1.2.5 结冷胶发酵的研究
            1.2.6 结冷胶的应用
        1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术的概述
            1.3.1 CRISPR/Cas9系统在细菌中的工作原理
        1.4 透明颤菌血红蛋白
            1.4.1 概述
            1.4.2 透明颤菌血红蛋白（VHb）的结构
        1.5 乙酰基转移酶（nat）基因
        1.6 本文研究意义及内容
第二章 结冷胶生产菌株代谢工程改造
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 菌株与质粒
        2.2 主要仪器设备
        2.3 主要试剂
        2.4 培养基
        2.5 主要溶液的配制
    3 实验方法及步骤
        3.1 结冷胶生产菌株的培养
        3.2 透明颤菌的培养
        3.3 引物设计
        3.4 菌株基因组DNA的提取
        3.5 乙酰基转移酶基因（nat）的克隆
        3.6 克隆基因片段的胶回收
        3.7 感受态大肠杆菌的制备
        3.8 p MD19-T-nat的构建
        3.9 p EASY-Blunt Zero-nvn克隆载体的构建
            3.9.1 乙酰基转移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆
            3.9.2 透明颤菌血红蛋白基因（vgb）的克隆
            3.9.3 一步重叠PCR
            3.9.4 克隆载体p EASY-Blunt Zero-nvn的构建
        3.10 表达载体p Target F-New-vgb的构建
        3.11 少动鞘氨醇单胞菌JLJ感受态细胞的制备
        3.12 电转化少动鞘氨醇单胞菌JLJ
        3.13 重组菌株JLJ-vgb中质粒的消除
        3.14 重组菌株JLJ-vgb的鉴定
            3.14.1 PCR鉴定
            3.14.2 SDS-PAGE分析
            3.14.3 VHb活性的测定——CO差光谱法
            3.14.4 重组菌株的传代培养
            3.14.5 重组菌株稳定性检测
        3.15 结冷胶产量的测定
        3.16 发酵培养基中生物量的测定
        3.17 重组菌株发酵培养基及发酵工艺的优化
            3.17.1 单因素实验
            3.17.2 响应面法优化实验
    4 结果与分析
        4.1 结冷胶生产菌株的改造
            4.1.1 基因敲入靶位点的克隆
            4.1.2 pEASY-Blunt Zero-nvn克隆载体的构建
                4.1.2.1 乙酰基转移酶（nat）基因上下游同源臂的克隆
                4.1.2.2 vgb基因的克隆
                4.1.2.3 一步重叠PCR
            4.1.3 表达载体p arget F-New-vgb的构建
            4.1.4 重组菌株JLJ-vgb的获得及鉴定
                4.1.4.1 PCR鉴定
                4.1.4.2 SDS-PAGE分析
                4.1.4.3 VHb蛋白活性的检测
                4.1.4.4 重组菌株JLJ-vgb稳定性分析
        4.2 重组菌株JLJ-vgb发酵培养基及发酵工艺的优化
            4.2.1 碳源种类及浓度的优化
            4.2.2 氮源种类及浓度的优化
            4.2.3 发酵条件的优化
            4.2.4 响应面法优化实验
                4.2.4.1 响应面法实验设计及模型建立
                4.2.4.2 模型 3D及等高线分析
                4.2.4.3 模型的验证
    5 结论
参考文献
致谢
附录一 乙酰基转移酶基因序列
附录二 pEASY-Blunt Zero-nvn部分基因序列
附录三 pTarget F-New反向PCR部分基因序列
附录四 pTarget F-New-vgb表达载体部分基因序列
附录五 重组菌株JLJ-vgb vgb基因序列


【参考文献】：
期刊论文
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[2]透明颤菌血红蛋白基因在酶工程中的应用[J]. 王兴吉,佟新伟,刘文龙,张杰.  食品与发酵科技. 2017(06)
[3]结冷胶发酵工艺优化[J]. 赵体金.  现代农业科技. 2016(15)
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[5]结冷胶研究进展[J]. 文春溪,刘钟栋.  中国食品添加剂. 2014(01)
[6]微生物多糖结冷胶的发酵过程优化[J]. 李传宝,黄金,何军邀,王普.  食品与发酵工业. 2013(04)
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博士论文
[1]结冷胶的发酵过程优化及其在食品中的应用研究[D]. 朱桂兰.江南大学 2015

硕士论文
[1]结冷胶生产菌株选育及发酵优化[D]. 徐力.浙江工业大学 2015
[2]结冷胶发酵工艺的研究[D]. 王歆童.河南大学 2011
[3]高酰基结冷胶的特性及其对果粒酸性乳饮料体系的影响[D]. 卢晶.浙江工商大学 2011
[4]人乳铁蛋白、胸腺肽融合基因在毕赤酵母与生菜中表达的研究[D]. 孟志刚.西北农林科技大学 2005
[5]碱性蛋白酶的发酵与酶学性质的研究[D]. 苑琳.天津科技大学 2004



本文编号：3639040