2-酮基-L-古龙酸高产菌株的定向选育

发布时间：2022-11-12 11:21

　　2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonic acid,2-KLG）是发酵法生产维生素C的直接前体。山梨糖脱氢酶（Sorbose dehydrogenase,SDH）是实现一菌一步发酵生产维生素C的关键节点之一。在前期研究中,本实验获得了一个来源于原始菌株氧化葡萄酸杆菌（Gluconobacter oxydans）WSH-004的FAD依赖的山梨糖脱氢酶,可以在不同的表达体系中实现活性表达。由于该山梨糖脱氢酶活性较低,如果需要利用其进行一菌一步发酵生产2-KLG,需要对其酶活进行大幅提升。本实验将来源于G.oxydans WSH-004的山梨糖脱氢酶在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行异源表达,发现该酶在E.coli中可以直接发酵催化L-山梨糖生成2-KLG。通过优化启动子、表达宿主筛选、优化发酵温度、敲除醛酮还原酶基因、敲除磷酸转移酶系统（Phosphotransferase system,PTS）中的相关酶基因和通过易错PCR对山梨糖脱氢酶进行随机突变等方法,从而构建一个适合研究山梨糖脱氢酶的高通量筛选平台。研究结果对代谢工程改造微生物实现一菌一步发酵生产... 

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 维生素C概述
    1.2 目前国内外维生素C的研究现状
        1.2.1 两步发酵法产维生素C研究状况
        1.2.2 一菌一步发酵法产维生素C研究状况
    1.3 L-山梨糖到2-KLG代谢途径中的其它相关研究进展
        1.3.1 2-KLG到L-艾杜糖酸的代谢途径
        1.3.2 代谢途径中L-山梨糖参与的作用
    1.4 立体依据与研究内容
        1.4.1 立体依据
        1.4.2 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 培养基
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要仪器
    2.2 分子生物学操作
        2.2.1 重组质粒的构建
        2.2.2 阳性转化子的筛选与鉴定
        2.2.3 通过CRISPR-Cas9 技术敲除E.coli中的基因
        2.2.4 质粒的提取
        2.2.5 PCR产物的纯化回收
        2.2.6 E.coli电转感受态细胞的制备
        2.2.7 DNA片段的电转化
        2.2.8 质粒消除
        2.2.9 易错PCR
    2.3 培养方法
        2.3.1 细胞培养的方法
        2.3.2 摇瓶发酵培养
        2.3.3 共表达SDH和 SNDH的培养
        2.3.4 MMC培养
        2.3.5 进化菌株摇瓶发酵培养
        2.3.6 发酵条件优化
        2.3.7 发酵罐分批发酵
    2.4 纯化与分析方法
        2.4.1 酶的纯化
        2.4.2 菌体浓度的测定
        2.4.3 2-KLG和L-山梨糖浓度的检测
        2.4.4 高通量筛选方法
第三章 结果与讨论
    3.1 基于分子改造提高2-酮基-L-古龙酸的产量
        3.1.1 不同启动子对2-KLG产量的影响
        3.1.2 LC-MS鉴定目的产物与副产物
        3.1.3 筛选山梨糖脱氢酶表达宿主
        3.1.4 发酵温度对2-KLG产量的影响
        3.1.5 在E.coli BL21(DE3)中共表达SDH与 SNDH
        3.1.6 摇瓶中产物生成及底消耗物的基本变化趋势
        3.1.7 E.coli中醛酮还原酶基因的敲除
        3.1.8 敲除E.coli磷酸转移酶系统中的基因
    3.2 基于微液滴驯化提高L-山梨糖的耐受性
        3.2.1 耐高浓度L-山梨糖菌株的第一轮进化
        3.2.2 耐高浓度L-山梨糖菌株的第二轮进化
        3.2.3 进化菌株在摇瓶中的生长状况
        3.2.4 摇瓶发酵条件的优化
        3.2.5 不同底物浓度对2-KLG产量的影响
        3.2.6 L-山梨糖和2-KLG对菌体生长的影响
        3.2.7 5L罐上高密度发酵2-KLG的产量
    3.3 基于易错PCR筛选高产2-KLG的菌株
        3.3.1 2-KLG检测范围的确定
        3.3.2 多孔板高通量初筛体系
        3.3.3 摇瓶复筛
        3.3.4 山梨糖脱氢酶分段模块研究
        3.3.5 基于DS模拟的定点突变
结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]几种定向进化技术的比较及文库构建策略[J]. 贾向东,陈德富,陈喜文,郭少影.  中国生物工程杂志. 2003(12)
[2]混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用[J]. 冯树,张舟,张成刚,张忠泽.  应用生态学报. 2000(01)
[3]2-酮基-L-古龙酸的高效液相色谱分析[J]. 侯幼军,陈晓雨.  生物技术. 2005(05)
[4]酮古龙酸菌Y25 D-2-羟酸脱氢酶的表达、纯化与酶学性质[J]. 梁钰英,熊向华,朱斌,赵楠,汪建华,张惟材.  军事医学. 2014(07)
[5]微生物醛酮还原酶结构、功能及其在生物催化中的应用[J]. 史丽珍,应彬彬,王亚军.  发酵科技通讯. 2017(04)
[6]山梨酮脱氢酶模块与酮古龙酸杆菌底盘细胞的适配分析[J]. 陈思,贾楠,丁明珠,元英进.  生物工程学报. 2016(09)
[7]L-山梨糖发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究 Ⅰ.菌种的分离筛选和鉴定[J]. 尹光琳,陶增鑫,于龙华,王大耜,谈家林,严自正,宁文珠,王长会,王书鼎,姜慧凤,张秀明,冯晓云,赵强,魏文巧.  微生物学报. 1980(03)
[8]L-山梨糖发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究 Ⅱ.发酵条件的研究[J]. 严自正,陶增鑫,于龙华,尹光琳,宁文珠,王长会,王书鼎,姜慧凤,余菊芬,王明寿,于秀菊.  微生物学报. 1981(02)



本文编号：3706274