还原胺化酶AspRedAm催化生物基呋喃高值化转化的研究

发布时间：2024-04-28 02:06

　　5-羟甲基糠醛(HMF)和糠醛是重要的生物基平台化合物。N-烷基糠胺是诸多生物活性化合物的结构单元,可以通过生物基呋喃还原胺化得到。目前,N-烷基糠胺主要通过化学催化制备得到。尽管化学法已取得了较大进展,但该法仍存在羰基的自还原、亚胺或烯胺中间体的稳定性较差、目标产物胺的过度烷基化等问题。生物催化能有效克服上述问题。在众多催化C-N键形成的生物催化剂中,还原胺化酶更具潜力;相比于转氨酶和胺脱氢酶仅能催化伯胺的合成,还原胺化酶能催化生成仲胺。然而,生物催化生物基呋喃还原胺化合成N-烷基糠胺尚未见报道。源于Aspergillus aryzae的还原胺化酶(Asp Red Am)具有较宽的底物谱。基于上述情况,本论文探究了Asp Red Am催化生物基呋喃还原胺化的可行性,并基于分子对接分析,对Asp Red Am进行半理性分子改造以提高其催化生物基N-烷基糠胺合成效率;研究了还原胺化酶Asp Red Am催化羰基还原的多功能性。本研究取得的主要结果如下:1.Asp Red Am催化生物基呋喃还原胺化及分子改造。Asp Red Am不仅能催化HMF与正丙胺进行还原胺化,而且还展现出催化HMF...

【文章页数】：98 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 生物基呋喃
        1.1.1 5-羟甲基糠醛
        1.1.2 糠醛
    1.2 胺类化合物
    1.3 还原胺化
        1.3.1 化学催化还原胺化
        1.3.2 生物催化还原胺化
    1.4 还原胺化酶的性质、结构及分子改造
        1.4.1 还原胺化酶的性质
        1.4.2 还原胺化酶的结构
        1.4.3 还原胺化酶的分子改造
    1.5 本研究的主要内容和意义
第二章 AspRedAm催化生物基呋喃还原胺化与其分子改造
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 培养基配制
    2.2 实验设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 重组表达载体的构建及鉴定
        2.3.2 重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-AspRedAm的诱导表达
        2.3.3 还原胺化酶AspRedAm的分离纯化
        2.3.4 还原胺化酶AspRedAm催化HMF还原胺化可行性研究
        2.3.5 生物基N-烷基糠胺的化学合成
        2.3.6 底物摩尔比对AspRedAm催化HMF和正丙胺还原胺化的影响
        2.3.7 反应温度对AspRedAm催化HMF和正丙胺还原胺化的影响
        2.3.8 酶浓度对AspRedAm催化HMF和正丙胺还原胺化的影响
        2.3.9 生物催化5-[(丙胺基)甲基]-2-呋喃甲醇的放大合成
        2.3.10 高效液相色谱分析及1HNMR表征
        2.3.11 还原胺化酶AspRedAm与底物HMF的分子对接
        2.3.12 还原胺化酶AspRedAm突变体的获取
        2.3.13 AspRedAm突变体的诱导表达及分离纯化
        2.3.14 AspRedAm突变体催化HMF和正丙胺还原胺化的研究
        2.3.15 AspRedAm及突变体W210F和 L173N的酶活测定
        2.3.16 AspRedAm及突变体W210F与产物的分子对接
        2.3.17 AspRedAm及突变体W210F催化糠醛的还原胺化
        2.3.18 生物催化N-正丙基-2-糠胺的放大合成
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 重组表达载体的构建
        2.4.2 还原胺化酶AspRedAm的表达及分离纯化
        2.4.3 还原胺化酶AspRedAm催化HMF还原胺化可行性分析
        2.4.4 底物摩尔比对AspRedAm催化HMF和正丙胺还原胺化的影响
        2.4.5 反应温度对AspRedAm催化HMF和正丙胺还原胺化的影响
        2.4.6 酶浓度对AspRedAm催化HMF和正丙胺还原胺化的影响
        2.4.7 生物催化5-[(丙胺基)甲基]-2-呋喃甲醇的放大合成
        2.4.8 还原胺化酶AspRedAm突变位点的确定
        2.4.9 还原胺化酶AspRedAm突变体的获取
        2.4.10 AspRedAm突变体催化HMF和正丙胺还原胺化的研究
        2.4.11 AspRedAm及突变体W210F和 L173N的酶活测定
        2.4.12 AspRedAm及突变体W210F与产物的对接结果
        2.4.13 AspRedAm及突变体W210F催化糠醛的还原胺化
        2.4.14 生物催化N-正丙基-2-糠胺的放大合成
    2.5 本章小结
第三章 还原胺化酶AspRedAm的催化多功能性研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株和培养基
        3.1.2 主要试剂
    3.2 实验设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 AspRedAm及突变体N93A和 N93S的诱导表达及分离纯化
        3.3.2 AspRedAm及突变体N93A和 N93S的蛋白浓度及酶活测定
        3.3.3 AspRedAm及突变体N93A辅酶依赖性的研究
        3.3.4 AspRedAm及突变体N93A最适pH的研究
        3.3.5 AspRedAm及突变体N93A最适温度和温度稳定性研究
        3.3.6 金属离子对AspRedAm及突变体N93A酶活的影响
        3.3.7 AspRedAm及突变体N93A的底物特异性研究
        3.3.8 AspRedAm及突变体N93A的反应动力学研究
        3.3.9 AspRedAm及突变体N93A与底物HMF的分子对接
        3.3.10 AspRedAm及突变体N93A催化呋喃醛还原
        3.3.11 高效液相色谱分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 AspRedAm及突变体N93A和 N93S的还原活性
        3.4.2 AspRedAm及突变体N93A的辅酶依赖性
        3.4.3 AspRedAm及突变体N93A的最适pH
        3.4.4 AspRedAm及突变体N93A的最适温度和温度稳定性
        3.4.5 金属离子对AspRedAm及突变体N93A酶活的影响
        3.4.6 AspRedAm及突变体N93A的底物特异性
        3.4.7 AspRedAm及突变体N93A的反应动力学研究
        3.4.8 AspRedAm及突变体N93A与底物HMF的对接结果
        3.4.9 AspRedAm及突变体N93A催化呋喃醛还原
    3.5 本章小结
结论与展望
参考文献
附录
    附录1 基因序列
    附录2 校正曲线
    附录3 液相色谱图
    附录4 ¹H NMR图谱
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：3966015