甘油转运体GT1与锌转运体ZRT1协同调控巴斯德毕赤酵母锌稳态

发布时间：2024-10-28 19:31

　　巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。它含有两个醇氧化酶基因,aox1和aox2,它们具有强诱导型启动子,可被甲醇诱导并被葡萄糖、甘油抑制。由于巴斯德毕赤酵母具有高生长速率,能够在简单、廉价的培养基中生长,适合用于小规模发酵和大规模生产,且具有真核表达系统的翻译后修饰机制,而被广泛地用于重组DNA技术生产蛋白质。Gt1（glycerol transporter 1,GenBank:CP014715.1）基因编码巴斯德毕赤酵母的甘油转运体1（GT1）。GT1是跨膜蛋白,具有将甘油从胞外转运至胞内的功能。根据前期研究,在毕赤酵母GS115△gt1中,zrt1（GenBank:CP014717.1）的mRNA水平增高,暗示着GT1可能与ZRT1具有功能相似性,GT1能够行使转运甘油之外的其他功能。首先根据NCBI分析比对,毕赤酵母zrt1与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中编码高亲和力锌转运蛋白的zrt1（zinc-regulated transporter 1,GenBank:CP02916...

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 膜蛋白概述
        1.1.1 细胞质膜
        1.1.2 膜蛋白的功能
        1.1.3 MFS蛋白超家族
        1.1.4 ZIP和 Zn T蛋白超家族
    1.2 酵母细胞的锌稳态简介
        1.2.1 锌在细胞水平发挥的功能及作用
        1.2.2 酵母细胞锌稳态的调控模式
    1.3 课题研究目的及意义
        1.3.1 课题研究目的
        1.3.2 课题研究意义
    1.4 主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种及质粒
        2.1.2 主要试剂和材料
        2.1.3 培养基
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要设备仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 大肠杆菌感受态的制备
        2.2.2 质粒提取方法
        2.2.3 DNA片段的回收
        2.2.4 酶切连接
        2.2.5 热激法转化大肠杆菌
        2.2.6 阳性克隆的筛选
        2.2.7 GT1表达宿主、发酵条件、去污剂的筛选
        2.2.8 GT1和ZRT1的纯化
        2.2.9 SDS-PAGE和 Western Blot检测
        2.2.10 酵母感受态的制备与电转化
        2.2.11 CRISPR/Cas9 敲除gt1和zrt1
        2.2.12 酵母基因组提取
        2.2.13 酵母蛋白提取
        2.2.14 亚细胞定位的检测
        2.2.15 荧光定量PCR
        2.2.16 等温滴定量热(ITC)实验
        2.2.17 锌离子荧光定量
        2.2.18 胞外甘油含量的测定
第三章 结果与讨论
    3.1 GT1、ZRT1的生物信息学分析
    3.2 菌株构建
        3.2.1 GT1和ZRT1表达重组质粒的构建
        3.2.2 △gt1和△zrt1敲除菌株的构建
        3.2.3 HA标签、RFP融合表达菌株的构建
    3.3 GT1异源表达的条件优化
        3.3.1 重组蛋白重溶解去垢剂的筛选
        3.3.2 重组蛋白表达宿主的选择
        3.3.3 重组蛋白表达条件的优化
    3.4 重组蛋白的纯化与Western Blot检测
    3.5 GT1和ZRT1与ZnCl₂的ITC检测
    3.6 GT1和ZRT1的体内功能鉴定
        3.6.1 GT1和ZRT1的亚细胞定位
        3.6.2 GT1和ZRT1锌转运能力的鉴定
    3.7 锌对GT1和ZRT1 m RNA和蛋白表达的调控
    3.8 葡萄糖和甘油介导的GT1和ZRT1 m RNA和蛋白表达的调控
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：4008364