人源Nanog蛋白在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中可溶性表达及发酵优化

发布时间：2024-12-22 07:09

　　Nanog蛋白是维持胚胎干细胞自我更新和多能性的关键转录因子,特别是在肿瘤干细胞中,Nanog蛋白的表达与肿瘤的产生、发展和转移密切相关。随着对肿瘤干细胞基础研究的深入,相关的医学实验及药物研发生产对Nanog蛋白的需求也日益增多。目前体外生产Nanog蛋白的主要方式是利用微生物进行异源表达。已公开的报道主要是鼠源及猪源Nanog蛋白的原核表达,关于人源Nanog蛋白的原核表达研究报道较少且产量较低,不能满足日益增长的市场需求。人源Nanog蛋白的高效制备可以有效解决动物源Nanog蛋白在临床应用中引发的诸多不利因素,满足科研及生产需求。因此,本研究利用分子克隆技术构建了重组枯草芽孢杆菌及重组大肠杆菌表达菌株,并且探究了重组菌株的发酵特性。主要研究结果包括:（1）人源nanog基因与穿梭质粒pMA5双酶切后连接,构建成功的质粒转入枯草芽孢杆菌WB800中实现胞内表达。质粒稳定性检测发现传代96 h后携带重组质粒的菌落数下降至67%。培养基成分及培养条件优化后,Nanog蛋白产量达到189 mg·L^-1。（2）人源nanog基因与质粒pET-32a双酶切后连接,构建好...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-1Nanog蛋白与其他转录调控因子之间的相互作用

mu等[58]的研究表明采用TALEN和CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除nanog基因具有抑制前列腺肿瘤细胞的生长、转移，增加化疗敏感度的作用，但是Nanog蛋白在肿瘤干细胞中具体的作用机理仍然难以捉摸。(3)研究Nanog蛋白与其他转录调控因子之间的相互作用机制，从而探究....

图2-2蛋白浓度标准曲线

第二章材料与方法19第一阶段温度设定为37℃，重组菌在含有10g·L-1葡萄糖的培养基中扩增，通过葡萄糖定糖仪测定罐内葡萄糖残余量，待其消耗尽后，通过流动加入甘油的方式补充碳源。第二阶段在甘油补加3h后将温度分别设定为37℃、30℃，30℃维持0.5h，在变温后添加IPTG对重组....

图3-1重组质粒双酶切验证

第三章结果与讨论21第三章结果与讨论3.1Nanog蛋白在重组枯草芽孢杆菌中的表达3.1.1枯草芽孢杆菌重组表达载体的构建PCR产物经纯化试剂盒纯化后，连接至克隆载体pMD19-TSimpleVector。连接后转化至枯草芽孢杆菌WB800，挑取阳性转化子，进行菌落PCR验证，将....

图3-2枯草芽孢杆菌中Nanog的SDS-PAGEFig.3-2SDS-PAGEofNanoginBacillussubtilis

江南大学硕士学位论文22的蛋白液沉淀中也无法检测到相应大小的蛋白条带，说明Nanog蛋白仅在重组枯草芽孢杆菌WB800/pMA5-nanog中实现了胞内表达。图3-2枯草芽孢杆菌中Nanog的SDS-PAGEFig.3-2SDS-PAGEofNanoginBacillussubt....

本文编号：4019631