荷叶生物碱盐预防小鼠膳食诱导型肥胖及调节其肠道菌群的功效研究

发布时间：2020-04-05 14:00

【摘要】：肥胖是一个严重影响人类生活品质、让社会承受巨大负担的难题。治疗肥胖的药物大多对人体有不良的副作用,用植物来源的天然产物来进行膳食干预是一种相对健康、安全的方式。近年来,肥胖被证明与肠道菌群密切相关,这为肥胖的预防和治疗提供了一个新的思路。荷叶(Lotus leaf)是一种药食两用、产量丰富的资源,其富含生物碱、黄酮等活性物质,具有多种生物学功效。本文研究了荷叶生物碱盐的提取、纯化方法,探究了荷叶生物碱盐提取物(LLAS)预防小鼠高脂膳食诱导型肥胖(DIO)的功效及其对肠道菌群的影响。(1)采用单因素实验和响应面分析相结合的方法优化了荷叶生物碱盐的提取方案。优化后的方案为:加热温度60℃、超声功率500W、盐酸质量分数0.3%,超声时间41min,液固比27:1,此条件下荷叶碱得率为(4.12±0.05)mg/g,与预测值的误差小于1%。(2)采用大孔树脂纯化荷叶生物碱盐粗提物。考察了四种大孔树脂的吸附、解吸性能以及最大上样量,最大上样流速等指标。最终选取D101型大孔树脂进行纯化,2BV/h为最大流速,6BV为最大上样量,30%体积分数的乙醇作为除杂液,70%体积分数的乙醇作为洗脱液。纯化后总生物碱的纯度为40.80%,回收率为81.71%。(3)采用高脂膳食诱导肥胖小鼠模型,用高(80mg/kg/d)、低(40mg/kg/d)两种剂量的LLAS对小鼠进行膳食干预。结果表明:高、低剂量的LLAS均显著(p0.001)降低了高脂膳食小鼠(MC小鼠)的体重,显著(p0.05)减少了附睾脂肪、肝脏等器官和组织的脂肪堆积,显著(p0.05)降低了小鼠的摄食量,显著(p0.05)降低了血清中甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量,显著(p0.05)升高了密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量,没有影响血清中总胆固醇(T-CHO)的含量,显著(p0.05)提高了胰脂肪酶的活性;低剂量的LLAS显著(p0.05)改善了MC小鼠对胰岛素的敏感性;高剂量的LLAS显著(p0.05)提高了肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,显著(p0.005)降低了肝脏中丙二醛(MDA)的含量;高剂量的LLAS显著(p0.005)降低了MC小鼠附睾脂肪组织中肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的含量。(4)采用Illumina PE250高通量测序技术分析了LLAS对MC小鼠肠道微生物丰富、多样性、菌群组成等方面的影响。结果表明:高脂膳食会降低肠道菌群的丰富度和多样性,而LLAS对MC小鼠肠道菌群丰富度和多样性的影响不明显;高脂膳食的厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值显著(p0.005)增高,高剂量的LLAS使该比值显著(p0.05)降低;高剂量的LLAS能够显著(p0.05)降低高致病菌变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度,显著(p0.01)增加肠道益生菌阿克曼菌属(Akkermansia muciniphila)的相对丰度,降低有害菌脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的相对丰度,其对酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)相对丰度的影响不明显;LLAS能增加高脂膳食小鼠肠道中考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、Odoribacter等四种能产生短链脂肪酸的菌属的相对丰度,间接作用于中枢神经,调控食欲。综上所述,经过提取、纯化后的荷叶生物碱盐提取物对高脂膳食诱导肥胖型小鼠的膳食干预取得了良好的效果,表现在其有效抑制了MC小鼠体重的过度增长、提高了其对胰岛素的敏感性、提高了其肝脏的抗氧化水平、降低了其脂肪组织中炎症因子的水平。此外,LLAS对MC小鼠的膳食干预能调节其肠道菌群的结构,改善肠道微生态。故推测LLAS预防肥胖的机制可能是抑制胰脂肪酶、调节肠道菌群的结构,进而缓解慢性炎症反应,抑制食欲。
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浙江大学硕士学位论文第一章绪论5图1.1 荷叶中生物碱的结构Figure 1.1 Structure of alkaloids in lotus leaves1.2.2 生物碱的提取大部分荷叶中的生物碱类物质碱性较弱，，水溶性较差，可溶于甲醇、乙醚、氯仿等有机溶剂以及酸性溶液[46-47]。传统的溶剂提取法提取率较低，因此常用酶解[48]、超声[49]、微波[50]等方法来提高其提取率。蒋益虹[51]使用人工神经网络和正交实验相结合的方法优化了荷叶生物碱的提取方法，首先通过正交实验得出了影响荷叶生物碱提取效果的主次因素，再建立神经网络模型来对方案进行评估和优化，结合实际情况最终得出提取工艺参数为：pH为2.5，提取温度为85℃，提取时间为1.75h

曲线,曲线,标准品,响应面法

?第二章响应面法优化荷叶生物碱盐提取工艺及其纯化22图2.1 荷叶碱的标准曲线Figure 2.1 Standard curve of Nuciferine2.3.2 UPLC 分析荷叶生物碱如图2.2所示，从左到右依次为O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱的出峰，各标准品峰形稳定，分离度较好。各标准品的标准曲线如图2.3所示，三种标准品的拟合度高。图2.2 标准品UPLC图谱Figure 2.2 UPLC chromatogram of standard alkaloids
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.4

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