基于DNA检测的羊肉掺假鉴别技术研究

发布时间：2020-04-05 18:27

【摘要】：近年来,随着社会的发展,肉及肉类产品掺假现象日益突出。在中国,由于羊肉卷及羊肉串深受人们的喜爱。因此,羊肉掺假成为一些不法商贩谋取利润的手段,主要掺假现象是将价格低廉的鸭肉、猪肉及鸡肉掺入到价格昂贵的羊肉中,“挂狗头卖羊肉”的现象屡见不鲜。2013年,欧洲马肉风波事件引起了世界的关注,也引起了相关部门的重视。目前羊肉掺假的检测方法主要以核酸PCR检测为主,均为定性检测;近年来发展的数字PCR虽然可以对羊肉掺假进行定量检测,但需要昂贵的试剂及专业的操作技能,实验室检测所需时间较长,因此急需开发一种简单快速的羊肉掺假鉴别定量检测方法。本文研究了一种DNA快速提取液;建立了基于线粒体和核单拷贝基因的羊肉掺假PCR定量检测方法;开发了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)的羊肉快速鉴定试纸条。主要内容如下:(1)研究了不同的提取液对肉类DNA的提取效果,优化提取时间及浓度,通过比较,提取效果最佳的为NaOH提取液。该提取液可在5 min内完成对肉类DNA的提取,无需研磨、离心等步骤,配制简单,成本低,保存时间久。该提取液的研究为羊肉掺假快速检测方法的建立提供了先行条件。(2)基于羊线粒体基因筛选通用和羊源特异性引物,建立对羊肉产品中羊肉含量定量检测的PCR方法。将不同质量的羊肉与猪肉进行混合制备标准样品,根据羊肉所占比例与Ct比值(羊源特异性引物对标准样品扩增Ct值/通用引物对标准样品扩增Ct值)建立标准曲线,线性方程为Y=-0.3166X+1.2113,线性关系良好(R~2=0.9929)。通过对模拟样品进行检测,平均回收率为108.74%。表明该方法可以用于羊猪混合样品的定量掺假检测。(3)基于核单拷贝基因查找并筛选通用与羊源特异性引物,建立了快速定量检测羊肉掺假的荧光定量PCR方法。利用内参基因校正羊源种属特异基因的含量,根据初始模板浓度的对数与标准DNA溶液PCR扩增的Ct值建立内参基因与羊源性特异基因的标准曲线,线性方程分别为Y=-3.9416X+27.954和Y=-3.5507X+28.844,相关系数分别为R2=0.9999与R2=0.9993。通过对模拟样品进行检测和计算,羊猪、羊鸭与羊鸡混合样品回收率分别为89.317%、95.11%和107.15%。该方法可以在3 h之内完成羊源性成分含量的鉴定工作,具有简单快速、灵敏度高、特异性好、成本低且便于推广等特点,为动物源性成分掺假量化检测提供了广阔的前景。(4)利用纳米金材料,研发了一种基于RPA可肉眼检测羊肉成分的胶体金试纸条。该方法可对羊肉成分进行定性检测,检测浓度范围为20 ng/μL-2 pg/μL,检测时间为30 min,检测结果肉眼可见。该方法操作简单、灵敏快速,对动物源性成分的现场检测具有重要意义。
【图文】：

鄩崛?DNA 稀释 10 倍与未稀释作为模板进行 RPA 扩增, 观察结果如图2.2。图 2.2 提取液条件优化Fig 2. 2 Condition optimization of lysate注: 1、2、3 为 NaOH 提取液提取 1、3、5 min(稀释 10 倍为模板); 4、5、6 为 PBS 提取液提取 1、3、5 min(稀释 10 倍为模板); 8、9、10 为 NaOH 提取液提取 1、3、5 min(原液为模板); 11、12、13 为 PBS 提取液提取 1、3、5 min(原液为模板); 7、14 为空白对照。M 为 600 bp。从图 2.2 可以看出，NaOH 提取液提取 DNA 在稀释 10 倍作为模板时，在 1、3 与 5min没有太大差别，PBS 提取液在 3 min 时扩增效率最好。对比稀释与未稀释的模板 DNA，结果表明，NaOH 提取液稀释后的扩增效率高于未稀释的，PBS 提取液在未稀释情况下没有扩增，，结论是稀释后扩增效率较高, 可能原因是提取液成分会抑制 RPA 扩增, 对比结果，选择NaOH 提取液

否稀释对 RPA 扩增的影响中只有 2 种提取液提取的 DNA 可以满足 RPA 要求行不同时间与是否稀释实验。对羊肉提取 1、3 与提取 DNA 稀释 10 倍与未稀释作为模板进行 RPA 图 2.2 提取液条件优化Fig 2. 2 Condition optimization of lysate图 2.1 不同提取液 RPA 扩增结果Fig 2. 1 RPA amplification with different extraction solution为 NaOH 提取液、Chelex 提取液与 PBS 提取液；2、4、6 为空白对照；
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS251.53;O652

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本文编号：2615370