低温胁迫米曲霉自溶制备鲜味酱油及呈味肽的分离鉴定

发布时间：2020-04-07 13:09

【摘要】：酱油是一种用豆、麦、麸皮为原料经微生物发酵酿造成的传统调味品,最早起源于中国,富含多种营养物质和生理活性物质。酿造酱油常用的微生物为米曲霉,过程中产生丰富的酶系。其中,谷氨酰胺酶是控制发酵食品风味的一种关键酶,它能催化谷氨酰胺分解为具有鲜味的谷氨酸和氨。目前市面上,酱油酿造过程中谷氨酰胺酶的活性较低,分解得到较少的谷氨酸,导致酱油成品鲜味和风味欠佳;而人工投入谷氨酰胺酶的生产成本过高,不利于工业化生产。低温胁迫属于环境胁迫的一种,能够诱导微生物自溶,引起生物体生化特性和生理机能的显著变化,如细胞膜、酶活性等。至今,关于低温胁迫米曲霉自溶产谷氨酰胺酶对高盐稀态酱油的影响还未见报道。本文研究了低温胁迫条件对高盐稀态发酵酱油品质的影响,包括酱醪发酵初期在低温胁迫条件(无盐或高盐)过程中多种酶活力和核酸含量的变化、酱油滋味物质的形成和释放规律,探究不同酱醪pH值发酵对酱油色、香、味的影响,并在此基础上通过混合型阴离子固相萃取、超高效液相色谱-质谱联用技术对酱油中的鲜味及厚味肽进行分离纯化和结构鉴定,旨在为应用低温胁迫于高盐稀态酱油的发酵提供理论依据和方法指导。实验结果如下:分析了不同酱油酿造工艺下,酱醪初期多种酶活力、核酸含量、pH值等变化以及酱油成品的基础理化指标、游离氨基酸组成和滋味感官评价。在低温条件下(4℃),远低于微生物生长的正常温度范围(25℃),核酸含量提高了15.67%以上,指示米曲霉菌丝体的自溶程度更大。在第9 d时,与对照组Control相比,LTSF滤渣中的谷氨酰胺酶活性增加了3倍,上清液中谷氨酰胺酶活性提升了65.17%;发酵60 d后,谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量分别增加5.73%和3.47%,总游离氨基酸含量最高。结合滋味感官评价,酱油的鲜味和厚味呈LTSFLTSHControl的趋势。不足的是,低温胁迫条件下,酱油的红、黄色指数降低,导致色泽更浅。研究了酿造过程中酱醪pH值对酱油感官品质的影响。结果表明,相较于自然pH值的酱油,调控酱醪pH值在6.5附近,其红、黄色指数、色深物质、色率均得到了显著提高(P0.05),分别提高了32.23%,18.29%,14.74%和21.05%;保留的谷氨酰胺酶和蛋白酶的活力越高,但总氮、氨基酸态氮、总糖含量无显著性差异。发酵90 d后,在调控pH值样品中,5 kDa肽段所占比例降低,而具有重要呈味作用的1-5 kDa肽段所占比例提高8.65%。QDA感官评价表明,调控pH值酱油的鲜味、厚味和咸味最为明显,苦味最淡。利用顶空固相萃取法(HS-SPME)提取酱油中的香气成分,并使用GC-MS分析结果,调控pH值和自然pH值酱油总共鉴定出106种挥发性香气物质,且醇、酯、醛、酮、酸等化合物种类较为丰富,而吡嗪、醇、酸、醛、酯等化合物含量相对较大,是酱油中的主要挥发性风味成分。调控pH值酱油中,除呋喃和酚类外,其他物质均显著增加(P0.05)。其中,吡嗪、醇、醛,分别提高了258%,211%和166%。酱油整体香气提升,具有更突出的焦糖香、醇香和土豆香,但烟熏香不如自然pH值下发酵的酱油。采用UPLC-MS/MS对Oasis MAX混合型阴离子固相萃取柱分离的酸性组分进行多肽纯化和结构鉴定。共鉴定出18种呈味肽,分子量均小于700 Da,除了三种五肽外,其他均为小分子的二肽、三肽或四肽。其中,肽ED、EE、EF、ESAY、AELY、FELT呈鲜、酸味,口感丰富,具有较低的阈值,肽ESAY还有利于浓厚感的延长;肽EM、EDD、QLLN稍鲜,口感较丰富,具有较高的阈值;肽QNM阈值最高,呈酸、涩味;肽SV、LLVVQ、ALVLL具有较突出的浓厚感;肽FELT、FLTW、LL、QVELF、NVP、LDP则具有苦、酸味。选择离子响应强度较大的多肽进行定向合成,将其反添加至酱油中,呈味特征分析表明,大多数含有一个或多个谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺的小分子肽具有鲜味;含有缬氨酸的小分子肽具有厚味。
【图文】：

色谱图,酱醪,色谱图,样品

(a) (b)图 3-15 不同 pH 值酱醪样品的肽分子量分布色谱图(a) 调控 pH 样品的肽分子量分布；(b)自然 pH 样品的肽分子量分布Fig.3-15 Chromatograms of molecular weight distribution in moromi of different pH(a) Molecular weight distribution of regulated pH soy sauce; (b)Molecular weight distributionof natural pH soy sauce综合来说，两样品的肽分子量大体处在 1-5 kDa 肽段范围内（＞50%）。调控 pH值＞自然 pH 值，1-5 kDa 肽段含量分别为 59.47%和 54.34%，样品间差异显著（P＜0.05）。可能是不同酱醪 pH 值发酵样品的各种酶活力差异所致。调控酱醪 pH 值至 6.5 附近，由于处于谷氨酰胺酶、中性蛋白酶、淀粉酶等最适 pH 值范围内，所以酶活较高，作用发挥充分，将大于 5 kDa 的肽段降解为更多 1-5 kDa 肽段。随发酵时间的增加，由于微生物的代谢作用，自然 pH 值样品的酱醪 pH 值不断下降到 5.0 以下，从而抑制了部分酶的活力，使得＞5 kDa 的大分子量肽段更易被保留，从而生成更少 1-5 kDa 的小分子肽段。

香气物质,酱油,固相微萃取法,吡嗪

第四章酱醪 pH 值对酱油香气物质的影响，已有部分物质被报道[13, 122, 178, 179]。根据固相微萃取法的图 4-4 和 4-5 可知，醇、酯、酮、酸几类化合物包含的种类最丰富，而吡嗪、醇、酸、醛、酯等化合物含量占很大比例，作为主要的风味贡献者。两个酱油样品中，，吡嗪类化合物含量都是最高的到 30.89%以上，且调控 pH 值样品的吡嗪含量更高，达到 37.81%，具有显著性差P＜0.05）。整体上，顶空-固相微萃取法能较为全面地将酱油中的香气物质提取出来是对酮类、呋喃等难挥发的风味物质的萃取效果欠佳。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS264.21

【参考文献】