淡水鱼发酵过程中N-亚硝胺的形成及控制机制研究

发布时间：2020-04-07 17:02

【摘要】：生物发酵技术能够有效解决传统发酵鱼制品生产过程中普遍存在的生产周期长、发酵条件难控制、产品品质不稳定等问题,近年来成为淡水鱼加工领域研究的重点和热点之一。本研究室团队前期运用生物发酵技术接种发酵酸鱼,显著提高了酸鱼产品的质构、风味和营养品质,但目前对于发酵鱼制品中N-亚硝胺(NA_s)及其前体物质的相关研究还未见报道,使得产品安全性难以保证。同时,接种发酵对NA_s的作用及机制尚不清楚。本文以典型发酵鱼制品酸鱼为研究对象,首先调查了市售相关产品的安全性现状,在此基础上以酸鱼中筛选出的植物乳杆菌L_p-120、酿酒酵母S_c-2018和木糖葡萄球菌S_x-135作为发酵剂,通过研究接种发酵对酸鱼中NA_s及其主要前体物质生物胺(BA_s)和亚硝酸盐的影响,分析酸鱼发酵过程中NA_s的主要影响因素,探索N-亚硝基二甲胺(NDMA)的降解途径,揭示微生物对NA_s的降解机制。本研究对了解接种发酵对酸鱼中NA_s的影响机制具有重要的学术意义,也为传统发酵鱼制品加工过程中NA_s的控制提供了理论指导。考察了市售传统发酵鱼产品中BA_s、亚硝酸盐和NA_s的含量情况。利用传统化学分析方法、反向高效液相色谱技术和分散固相萃取结合气相色谱-三重四极杆质谱技术,分别调查了来自不同省份的33个传统发酵鱼产品中NA_s及其前体物质BA_s和亚硝酸盐的含量情况。结果表明:所有市售样品中亚硝酸盐含量范围为未检出(ND)-1.19 mg/kg,显著低于(P0.05)国标GB 2760-2014对食品中亚硝酸盐的限量值(30 mg/kg);所有样品中BA_s含量均处于较低水平,仅有一个来自广西的样品中组胺(HIS)含量超过美国食品药品管理局的限量标准(50 mg/kg);另外,大量样品中检测出了6种NA_s残留,包括NDMA、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基吗啉(NMOR)和N-亚硝基二苯胺(NDPhe A);约36%样品中的NDMA含量超过中国卫生部的限量标准(4μg/kg),而约64%的样品中总NA_s含量超过美国农业部的限量(10μg/kg);主成分分析结果表明传统发酵鱼中NDMA和总NA_s的积累与HIS、酪胺(TYR)和硝酸盐的含量水平密切相关。研究了接种发酵对酸鱼发酵过程中BA_s的影响。分别以单一菌株(L_p-120、S_c-2018和S_x-135)和混合菌株(L_p-120:S_c-2018:S_x-135=1:1:1)作为发酵剂接种发酵酸鱼,自然发酵组作为对照,测定发酵过程BA_s含量变化情况,同时分析了酸鱼发酵过程中微生物特性、p H、总酸、α-氨基态氮、TCA-溶解肽、蛋白酶活性、游离氨基酸等的变化情况。结果表明:各发酵组中均未检测到HIS残留,腐胺(PUT)和TYR是酸鱼中主要的BA_s;L_p-120和S_x-135接种发酵可显著抑制(P0.05)酸鱼中PUT的积累,而混合发酵剂接种对TYR有显著的抑制效果(P0.05);发酵结束时,各组酸鱼中尸胺(CAD)(8.22-20.03 mg/kg)、亚精胺(SPD)(6.60-8.11 mg/kg)和精胺(SPM)(7.94-9.62 mg/kg)均处于较低含量水平;皮尔逊相关系数分析结果表明总BA_s含量与蛋白酶活性和α-氨基态氮含量呈显著相关(P0.05)。探究了酸鱼发酵过程中亚硝酸盐的降解途径。在模拟体系中分别考察了不同p H值乳酸溶液、单一菌株(L_p-120、S_c-2018和S_x-135)和可溶性蛋白溶液对亚硝酸盐的降解作用,揭示酸鱼发酵过程中影响亚硝酸盐含量的主要因素,同时以自然发酵组为对照,测定L_p-120、S_c-2018、S_x-135和混合菌株(L_p-120:S_c-2018:S_x-135=1:1:1)接种发酵对酸鱼中亚硝酸盐的影响。结果表明:菌株L_p-120、S_c-2018和S_x-135在模拟体系中均能直接降解亚硝酸盐,降解率分别为90.70%、78.75%和13.09%;4%-6%的Na Cl含量可显著提高(P0.05)L_p-120和S_c-2018的亚硝酸盐还原酶(Ni R)活性;亚硝酸盐在可溶性草鱼蛋白中会发生降解,且降解率与蛋白液浓度呈正相关;L_p-120、S_c-2018和S_x-135接种发酵可显著减少(P0.05)酸鱼中亚硝酸盐和硝酸盐的积累量。研究了接种发酵对酸鱼中NA_s的影响及降解途径。分别以单一菌株(L_p-120、S_c-2018和S_x-135)和混合菌株(L_p-120:S_c-2018:S_x-135=1:1:1)接种发酵酸鱼,自然发酵组为对照,考察发酵过程中NA_s及其前体物质的变化情况,探究接种发酵对酸鱼中NA_s的影响途径。结果表明:菌株L_p-120、S_c-2018和S_x-135在模拟体系中具有直接降解NDMA的能力,而L_p-120和S_c-2018可通过氧化三甲胺脱甲基酶途径降解氧化三甲胺;接种发酵可显著抑制(P0.05)酸鱼发酵过程中挥发性盐基氮和三甲胺的积累,而L_p-120、S_c-2018和混合发酵剂接种发酵可显著降低(P0.05)发酵结束时酸鱼中的二甲胺残留;酸鱼发酵过程中能检测到6种NA_s(包括NDMA、NMEA、NPIP、NPYR、NMOR和NDPhe A),而接种发酵可显著抑制(P0.05)NDMA、NPYR和NDPhe A的积累。研究了接种发酵对酸鱼体外模拟消化过程中NA_s及其前体物质的影响。建立体外模拟胃肠液消化体系,分析各发酵组酸鱼样品在不同消化阶段微生物、BA_s、亚硝酸盐和NA_s的变化规律。结果表明:胃液消化过程可显著抑制(P0.05)乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌和肠道菌的生长,而在小肠消化阶段,各种微生物又能大量增殖;小肠消化过程可显著提高(P0.05)酸鱼中PUT、CAD和TYR含量,而接种发酵可能对它们在小肠消化阶段的积累有一定的抑制作用;胃液消化过程可显著抑制(P0.05)各发酵组酸鱼中亚硝酸盐的积累,而小肠消化阶段各组样品中亚硝酸盐含量又显著增加(P0.05),但接种发酵组中的增加量均小于自然发酵组,说明接种发酵可能对该过程中亚硝酸盐的抑制有积极作用;胃液消化过程显著提高了(P0.05)酸鱼中NDMA的含量,而L_p-120、S_c-2018和混合发酵剂接种发酵对该过程NDMA的积累有一定的抑制作用。本文明确了酸鱼中NA_s的种类和含量水平,证实了接种发酵能够有效抑制酸鱼中NA_s的积累,发现了发酵剂对NA_s的前体物质BA_s和亚硝酸盐的抑制作用,阐明了微生物对NDMA的降解途径,初步揭示了接种发酵对酸鱼中NA_s的降解作用及机制。
【图文】：

胆碱,肉制品,热加工,途径

第一章绪论在有氧情况下，NO+可能来自于气态氮氧化物，如：N2O3和 N2O4。而在厌氧条件下，NO 可与某些阴离子（X）反应生成强亚硝化试剂（NOX）[54]。此外，亚硝化反应可在较宽的温度范围内进行。高温环境（≥100℃）能明显促进亚硝酸盐和二级胺间的反应，，但在生理温度（24-50℃）和冻结温度条件下，亚硝化反应仍能进行。1.2.2.1 N-亚硝基二甲胺NDMA 是加工肉制品中最常见的 NAs，其前体物质（三甲胺（TMA）和二甲胺（DMA））的主要来源可能是肉中的胆碱。胆碱是动物组织中卵磷脂的主要组成部分。在热加工肉制品中，NDMA 的增加主要是因为原料中的卵磷脂热降解生成胆碱，而胆碱进一步降解成 TMA[41]。在脱甲基后，产生的 DMA 又可通过亚硝化反应生成 NDMA[55]，反应通路如图 1-2 所示。

肉制品加工,途径研究,赖氨酸,途径

图 1-3 赖氨酸和 CAD 生成 NPIP 的可能途径Figure 1-3 Possible pathway for the formation of NPIP from lysine and CAD目前，有关肉制品加工过程中 CAD 生成 NPIP 的途径研究还较少。仅有Drabik-Markiewicz 等[59]在热加工肉制品体系中研究了 CAD 生成 NPIP 的途径，所得结果与之前在模拟体系中的结论相一致，据此可以断定 CAD 确实能够在高强度热加工条件下（≥160℃）转化为 NPIP。此外，肉类加工过程中 NPIP 的生成还可能与直接前体物质——哌啶的存在有关。加工过程中添加的调味料可能是哌啶和哌啶衍生物（如胡椒碱）的主要来源[61]。事实上，许多的研究都指出肉制品中高 NPIP 含量与较多调味料的添加密切相关[56, 62]。1.2.2.3 N-亚硝基吡咯烷NPYR 常出现在热加工肉制品中，油炸等强热加工条件会显著促进 NPYR 的形成[63]。随着热加工温度的提升，结缔组织中的胶原蛋白水解产生脯氨酸[41]。当环境温度在100-150℃时，NPYR 的形成主要来自于没有致癌性的前体物质——N-亚硝基脯氨酸（N-nitrosoproline，NPRO）。而当加热温度高于 175℃时，脯氨酸更容易脱羧基产生吡咯烷，而吡咯烷随后发生亚硝化反应生成 NPYR[64]。Drabik-Markiewicz 等[65, 66]明确了在
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.4

【参考文献】