枯草芽孢杆菌脱胶酶系的改良及在苎麻脱胶中的应用

发布时间：2020-04-10 21:31

【摘要】：苎麻等麻类纤维是优良的纺织原料之一,但在应用前必须进行脱胶处理,以去除韧皮纤维中的果胶物质并使纤维相互分离,赋予纤维优良的纺织性能和品质。与传统的化学法脱胶相比,利用微生物生产的酶代替化学品降解胶质复合物的酶法脱胶方法由于具有环境友好、对纤维损伤少等优点,成为麻类脱胶技术发展的必然趋势。实验室前期筛选的Bacillius ssutilis 7-3-3所产的碱性果胶酶对苎麻具有良好的脱胶效果,通过培养基组成和发酵条件优化、发酵过程调控、过表达果胶裂解酶PelA等措施,显著提高了该菌株产聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)的能力。但由于麻纤维中的果胶质具有复杂的组成和结构,它的降解需要一个复杂的酶系,在多种酶的共同作用下才能完成。为了进一步改良酶系,提高酶法脱胶效率,本论文在实验室前期研究基础上,研究了不同脱胶相关酶PelA、木聚糖酶(Xyn)和甘露聚糖酶(Man)等对苎麻的脱胶效果。论文首次实现了上述不同酶在B.suBtilis7-3-3中的同源共表达,同时提高了粗酶液中不同酶的活力,改善了菌株的酶系组成,显著提高了苎麻的脱胶效果。此外,论文还对来自B.subtili 的鼠李半乳糖醛酸聚糖酶进行了表达并初步探讨了其在苎麻脱胶中的作用。首先,利用穿梭质粒PNW33N在B.subtilis 7-3-3中分别同源过表达了果胶裂解酶A(PelA),木聚糖酶(Xyn)和甘露聚糖酶(Man),使其相应的酶活力分别达到了 870U/mL、400U/mL和43U/mL,与出发菌株相比,分别提高了10倍、20倍和2倍。在此基础上,通过更换甘露聚糖酶的启动子进一步将甘露聚糖酶的活力提升了约40%,达到68 U/mL;通过串联表达两个果胶裂解酶A的基因片段,使其PGL酶活力达到1324 U/mL,与单片段过表达PelA菌株相比,酶活提高约30%。本论文研究了上述不同工程菌株粗酶液对苎麻纤维的脱胶效果,通过考核脱胶率、抗张强度、残液中还原糖含量等指标,发现过表达PelA的工程菌株OE PelA的脱胶效果最佳,且脱胶后的纤维分散度高;但过表达木聚糖酶菌株OE Xyn和过表达甘露聚糖酶菌株OE Man与出发菌株B.subtilis 7-3-3相比,粗酶液的脱胶效果改善效果不大,说明相对而言,PelA在苎麻脱胶过程中的作用更为关键。其次,在B.subtilis 7-3-3中共过表达了Xyn和PelA。工程菌株OE PelA+Xyn发酵液中木聚糖酶和PGL的酶活力都获得提高,脱胶实验发现该工程菌株粗酶液的脱胶效果明显优于OEPelA的粗酶液,证明了PelA和木聚糖酶的共同作用有利于苎麻中果胶的降解脱除。进一步地,在B.subtilis 7-3-3中成功地共过表达了Xyn、Man和PelA三种酶组分,得到的工程菌株OE PXM的发酵液中果胶裂解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活力分别达到1028 U/mL、502 U/mL和25U/mL,与出发菌株B.subtilis 7-3-3相比,这三种酶的活力分别提高了 10倍、20倍和67%,使脱胶相关酶在整体分泌蛋白的占比增大,优化了枯草芽孢杆菌的脱胶酶系组成。初步研究了共过表达菌株OEPXM粗酶液的酶学性质,发现果胶裂解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适温度分别为60℃、50℃和50℃,最适pH值分别是9.5、8.0和8.5。利用共表达菌株OE PXM的粗酶液对苎麻进行脱胶,结果显示与其余单酶过表达菌株和OE PelA+Xyn等工程菌株相比,菌株OE PXM粗酶液的脱胶效果更优,且脱胶后纤维具有更高的强度,纤维也变得柔软。扫描电镜观察发现,经OEPXM粗酶液脱胶后的苎麻纤维表面变得更光滑、纤维分散度更高;红外分析表明,脱胶后苎麻的半纤维素的部分化学键发生断裂,证明了半纤维素酶在脱胶中的作用。此外,从苎麻中提取胶质复合物(包括半纤维素和果胶等组分)用于降解实验,结果发现菌株OE PXM的粗酶液比单酶过表达菌株OEPelA、OEXyn、OEMan和出发菌株B.subtilis 7-3-3的粗酶液具有更高效的降解能力,证实了果胶裂解酶和半纤维素酶在脱胶中的共同作用。果胶结构中存在着鼠李糖和半乳糖醛酸交替连接形成的主链,其在果胶中占有约35%的比例,推测鼠李半乳糖醛酸聚糖酶在果胶的降解中也可能发挥重要作用。前期在B.subtilis 7-3-3的基因组中分析得到一个鼠李半乳糖醛酸聚糖降解的基因簇,大小约为26 kbp,其中含有若干与鼠李半乳糖醛酸聚糖降解相关的蛋白基因。分别选取了4个基因片段,将其中无信号肽的基因片段3851、3856和3864分别表达在大肠杆菌中,带有信号肽的3859片段表达在枯草芽孢杆菌中,分别得到了其目的蛋白。进而以不同脱胶酶系为基础,添加上述不同蛋白进行脱胶实验,初步研究结果发现添加蛋白3851、3856和3864后,对苎麻的脱胶效果没有明显促进作用,而蛋白3859在枯草芽孢杆菌中的过表达则可以提高对苎麻的脱胶效果,为下一步菌株脱胶酶系的进一步优化提供了参考。
【图文】：

果胶酶,果胶酸,果胶,原果胶

胶酶（ＰＰａｓｅ），，其将不溶性原果胶转化为可溶性果胶（Ａｌｋｏｒｔａｅｔａｌ．，邋１９９８；Ｋａｓｈｙａｐ逡逑ｅｔａｌ．，邋２００１；邋Ｓｈａｒｍａｅｔａｌ．，２０１３；邋Ｇａｒｇｅｔａｌ．，２０１６；邋Ｈａｓｓａｎ＆Ａｌｉ，２０１６；邋Ｋａｚｕｈｉｓａｅｔ逡逑ａｌ．，２００１邋）。果胶酶的分类见图１－２所示。逡逑果胶底物逡逑＾￣，逦Ｉ逦；逡逑Ｉ邋，邋Ｉ邋￣邋Ｉ逦，￣；），逡逑（邋原果胶逦（果胶酸逦＊半乳糖醛酸逡逑｜邋ＰＰａｓｅ逡逑果胶（可溶）逦｜逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑Ｉ逦￣￣ｒ－１￣￣＾逦消除逦水解逦水ｆ逦氙除逡逑■消Ｌ去甲１化“二〔—卜孔１以．２．２．６邋ｆＧ逡逑ｅｎｄａ－ＰＮＬ逦｜邋ＥＣ４．２邋２邋２邋｜ｅＣ４．２．２．９逦不饱和荽乳糖醒逡逑ｅｎｄ0邋ＰＭＧ邋ＥＣ４．２．２．１０不饱和半乳糖三半逦｜｜糖逡逑，，逦酵酸逦乳糖薛酸逡逑甲ＢＢ半乳糖＿逡逑ＰＭＥ逦ＰＡＥ逡逑ＥＣ邋３．１．１．１１逦ＥＣ３．１．１．６逡逑果胶酸＆甲醇果胶酸＆乙醇逡逑图１－２果胶酶的分类逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆｐｅｃｔｉｎａｓｅ逡逑４逡逑

示意图,果胶结构,示意图

１．２．２．邋３鼠李半乳糖醛酸聚糖酶逡逑果胶的一级结构由线性（同型半乳糖醛酸，ＨＧ）和分枝（鼠李糖半乳糖醛逡逑酸，ＲＧ）区域组成（图１－３）。ＨＧ是ａ－１，４糖苷键连接的半乳糖醛酸（聚半乳逡逑糖醛酸）的线性均聚物，其中包含约７０％的半乳糖醛酸残基。在分枝（毛状）逡逑区域内，可以发现两种类型的多糖，ＲＧ－１和ＲＧ－ｎ。ＲＧ－１的主链具有含有半乳逡逑糖醛酸（ＧａｌＡ）和鼠李糖（Ｒｈａ）残基的重复二糖单元，而ＲＧ－ＩＩ是含有ＨＧ骨逡逑架的支链肽结构域，目前发现其侧链上具有１１种不同类型的糖（ＨｅｎｋＡ，１９９５）。逡逑ＲＧＩ类型的多糖结构占果胶总成分的３５％。有研宄表明，鼠李半乳糖醛酸聚糖逡逑酶是糖苷水解酶１０５家族，有糖苷水解酶功能，作用于二糖单元之间糖苷键逡逑（Ｔａｋａｆｉｉｍｉｅｔａｌ．，２００６）。因此推测在果胶的降解中，鼠李半乳糖醛酸酶必将发挥逡逑重要作用。目前己从许多真菌和细菌菌株中鉴定出了鼠李半乳糖醛酸酶
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS123

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