豆制品中菌落总数的流式细胞术检测研究

发布时间：2020-04-16 12:23

【摘要】：食品安全问题在全球范围内日益严峻,尤其以食源性致病菌为主要因素导致的食品安全事件时常发生。对于豆制品行业而言,国家有关部门已经颁布了GB2712-2014《食品安全国家标准豆制品》对豆制品卫生安全进行预防控制,但是其中并无关于豆制品菌落总数要求,只有大肠菌群的限量要求。由于豆腐为即食食品,实践中,采用绢豆腐卫生标准(GB/T22106,NY/T1052),对豆腐进行卫生安全评估分析,需要进行菌落总数检测,所用方法是国标法:GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数的测定》,这一方法采用的是平板琼脂计数方法对菌落总数进行检测计数,但是该计数方法工作量大,工作周期长,步骤繁杂等缺点不能满足市场快速检测需求。因此当前急需一种快速,准确,高效的食品中菌落总数计数的方法。食品检样经处理,在一定温度,时间,pH条件下所得1mL(g)检样中形成菌落的总数,只包括一群在培养基上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数,菌落总数不等于细菌总数。本论文采用了流式细胞术建立豆制品中菌落总数的检测方法,利用荧光染料PI及SYTO对样品颗粒物染色,进而区分杂质以及活性与非活性菌,最终检测得到菌落总数计数结果。结果表明检测限和检测时间分别为10~2cell/μL,2 min,且具有较高稳定性和重复性。第一个部分,由于豆腐中微生物数量较少,含有颗粒物影响检测结果准确性,因此需要进行样品前处理以减少干扰。本实验包括稀释液对样品前处理的影响,前增菌时间对前处理结果影响,以及不同初始比例豆腐前处理优化研究。结果表明梯度稀释稳定性较好,最佳前增菌时间为1 h,最佳初始比例豆制品为25 g+225mL。第二个部分,荧光染料各种组合对检测结果有较大影响,本文研究了不同荧光染料组合对检测结果影响和区别,以及不同荧光染料染色效果和结果,实验结果表明,最佳染料组合为PI+SYTO,最佳染料体积比为PI:SYTO~?24为5μL+5μL(1:1)。第三个部分,建立了流式细胞术检测豆制品中菌落总数的方法,用大肠杆菌或金黄色葡萄球菌添加至豆腐中进行模拟检测,结果表明,流式细胞术检测方法适用于样品颗粒物浓度大于或者等于10~4/g(mL)的研究对象,在实际检测过程中,样品颗粒物终浓度应当尽量控制在10~5至10~7/mL之间。结果表明,荧光染料PI的最佳添加浓度为5μg/mL,荧光染料SYTO~?24的最佳添加浓度为0.05mmoL/mL,孵育的最佳时间为5 min,最佳的上样速度为30μL/min,数据读取时间为120 s。此外,进一步研究了流式细胞术图像处理的方法,比较了自动设门和手动设门的差异,结果表明,两种设门方式在计数结果和分析上并无明显的差异,数值相差大小均小于一个数量级,因此,实验中两种设门方式均可使用,后续实验采用手动设门。流式细胞术检测方法和国标方法结果对比后,可以得知,在10~3至10~7 CFU/mL区间范围内,流式检测方法和国标法存在着较为显著相关性关系。此外,比较流式法与国标法检测结果,表明流式方法具有较好重现性,稳定性。对同一类型样品进行了平行实验,检测结果表明cv%均在5%以内。综上,本文建立了流式细胞术检测豆制品中菌落总数研究方法,并在样品预处理,荧光染料组合的选择等领域作出探讨,进而开展了研究,结果表明流式细胞术是一种快速,准确,高效的检测方法。未来流式细胞术在食品微生物领域应用研究具有广阔前景。
【图文】：

豆制品,企业数量,年产量,生产许可证

图中可以看出近十年来大豆行业的年产量，在整体趋势上增加迅猛，常大，在 2012 年之后，年产量逐年增加，在 2008 年，年产量就达到多，2011 年到 2012 年趋势稍有减缓，从 2016 到 2017 一年间年产量吨，数目庞大，市场越来越广阔。

豆制品,消费量,年产量

图 1-1 豆制品需求及消费量图从图中可以看出近十年来大豆行业的年产量，在整体趋势上增加迅猛，市非常大，，在 2012 年之后，年产量逐年增加，在 2008 年，年产量就达到 5之多，2011 年到 2012 年趋势稍有减缓，从 2016 到 2017 一年间年产量就亿吨，数目庞大，市场越来越广阔。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS207.4

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