松二糖的酶法制备研究

发布时间：2020-05-01 14:33

【摘要】：松二糖是一种天然存在于蜂蜜中的还原性二糖,由一分子葡萄糖与一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成,为蔗糖的一种同分异构体,其甜度达到蔗糖的一半。由于松二糖容易结晶、高度可溶、水解速率慢,不易被致龋微生物发酵,适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用,因此具备代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力,在食品工业领域中具有广阔的应用前景。目前仅有两种酶法制备松二糖的报道:其一,嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)可利用α-环糊精为最佳糖基供体有效合成松二糖,其产率可达45%,然而α-环糊精价格昂贵并不适用于工业化生产;其二,多糖奈瑟球菌(Neisseria polysaccharea)来源的淀粉蔗糖酶(Amylosucrase,ASase)可直接将蔗糖异构为松二糖,其产率为56%,同时发现另外添加果糖作受体可提高至73%,然而在该反应过程中副产物麦芽寡糖的生成会影响最终的产率,此外,为进一步增加松二糖在食品领域中应用的可能性,还需要选择以食品安全菌株为宿主对酶进行异源表达。由于CGTase具有利用廉价的淀粉衍生物为原料生产高附加值产品的潜力,而淀粉蔗糖酶的转化率较高,因此本文对该两种酶法制备松二糖的工艺均展开研究。一方面,以低成本的玉米淀粉衍生物麦芽糊精代替α-环糊精,对B.stearothermophilus CGTase催化合成松二糖的酶转化条件进行了优化;另一方面,优化合成淀粉蔗糖酶基因npas,对其进行分子改造以减少副产物的生成,同时将野生酶及突变体转化食品安全菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WS11),进行蛋白纯化及酶学定性,在此基础之上,以野生酶为对照,考察突变体催化制备松二糖的性能,最后优化该重组菌的摇瓶发酵条件及考察其在3-L发酵罐中的高密度培养情况。主要研究结果如下:(1)利用本实验室前期构建的菌株E.coli/pET-20b(+)-cgt~(opt)制备CGTase,为了降低生产成本,以价格低廉的玉米淀粉衍生物麦芽糊精代替α-环糊精作供体,以果糖为受体,考察了不同条件对B.stearothermophilus CGTase合成松二糖的影响。结果表明,当麦芽糊精DE值为16-20时,在50°C、反应初始pH 6.0、加酶量10 U·mL~(-1)的条件下,供体和受体的浓度均为300 g·L~(-1),反应24 h并经糖化酶糖化后,松二糖的产量可达150 g·L~(-1)。(2)优化合成N.polysaccharea来源的淀粉蔗糖酶基因npas,对其进行分子改造,将+2亚位点处的第396位甘氨酸残基(Gly)突变为丝氨酸残基(Ser),通过增大空间位阻的方式以减弱聚合活性、减少副产物麦芽寡糖的生成。构建重组质粒pHY300PLK-npas和pHY300PLK-npas G396S,转化食品安全菌株B.subtilis,经TB摇瓶发酵后的酶活分别为0.8 U·mL~(-1)和0.6 U·mL~(-1),蛋白电泳显示约在66.2 kDa处出现目的条带,并对野生酶与突变体进行了纯化,测定的比活分别为1.11 U·mg~(-1)和0.94 U·mg~(-1),两者的酶学性质也很接近:最适温度50°C、最适pH 7.0,在30°C下半衰期为40 h,pH在6.0-8.0范围内相对酶活均可维持在90%以上。(3)考察了重组酶NpAS G396S催化制备松二糖的性能,对其酶转化工艺进行优化,结果表明,以684 g·L~(-1)蔗糖为底物,在pH 7.0、反应温度30°C、加酶量0.8 U·mL~(-1)的条件下反应48 h后,松二糖的产量为410 g·L~(-1),比野生酶NpAS的产量提高了50 g·L~(-1),此时产率可达60%。此外,探究了添加果糖作受体对合成松二糖的影响,与NpAS相比,NpAS G396S的最优果糖浓度由135 g·L~(-1)减少到90 g·L~(-1),不仅降低了成本,而且松二糖的产率由73.3%提高至76.75%,此时产量为525 g·L~(-1)。(4)对重组菌B.subtilis/pHY300PLK-npas G396S的摇瓶发酵条件进行了优化,确定培养基的最佳组成为10 g·L~(-1)西王豆粕粉、15 g·L~(-1)西王大豆蛋白胨、5 g·L~(-1)甘油或葡萄糖、1 mM Mg~(2+)、12.54 g·L~(-1) K_2HPO_4和2.31 g·L~(-1) KH_2PO_4,此时酶活约为1.3 U·mL~(-1)。然后考察了其在3-L罐中高密度发酵的情况,发现当以葡萄糖为碳源时,重组菌所产生的酶蛋白主要集中在胞内,胞外分泌很少,而且随着发酵时间的延长逐渐失活,但若以甘油为碳源,则可有效抑制发酵后期酶活的下降,而且酶蛋白的胞外分泌增多,在33°C、pH 7.0、溶氧30%的条件下,当发酵至80 h时,菌体OD_(600)达到120,此时总酶活约12.5U·mL~(-1),约是摇瓶发酵的10倍。
【图文】：

化学结构,绪论,防御机制,甜味

第一章绪论第一章绪论是天然存在于蜂蜜中的还原性二糖(含量约一分子葡萄糖与一分子果糖以 α-1,3 糖苷在，除了涉及植物的信号传导和防御机制为蔗糖的 50%，水解速率为蔗糖的 54%，C 条件下与甘氨酸反应呈棕色，而蔗糖溶度、气味、刺激性和甜味持久性等均与蔗

催化反应,类型,聚合反应,异构

图 1-2 淀粉蔗糖酶的催化反应类型Fig. 1-2 Catalytic types of amylosucrase述，淀粉蔗糖酶的转苷反应包括聚合与异构两大类型，而初的关键因素[39]。在制备松二糖的过程中，，尽管聚合反应在一所抑制，但反应至后期随着蔗糖浓度的减少，聚合反应的发因此为进一步提高松二糖产量，减弱聚合反应、促进异构反saccharea 来源的淀粉蔗糖酶由 N、A、B、C、B’五个结构域构，C 域为 β-折叠结构，A 域为典型的(β/α)8-TIM 桶状拓扑sp286、Glu328 和 Asp393 构成催化三联体[40]，该活性中心似[41]。B 域仅由从(β/α)8-TIM 桶处 α-3 与 β-3 延伸出来的产物的多样性及稳定性相关。B’域由介于(β/α)8-TIM 桶处，与聚合活性紧密相关[42]。此外，NpAS 与麦芽七糖复合物聚焦与糖苷链的延伸相关的关键氨基酸残基，以便对其进在酶分子结构中共发现 3 个麦芽低聚糖结合位点(OB1-OB
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.2

【相似文献】