河蚬多肽体内外抗氧化活性及其对急性肝损伤保护的研究

发布时间：2020-05-11 20:40

【摘要】：氧化反应是生物体在新陈代谢过程中常发生的活动,活性氧(ROS)和活性氮(RN)作为其主要产物,在生理功能中起着双重作用。化学修饰的抗氧化剂对人体构成潜在危害而存在使用限制,所以从动植物中获取具有较高安全性和较高活性的天然抗氧化物质,对机体提高自身抗氧化能力具有重要意义。河蚬是一种双壳贝类,广泛分布于我国内陆水域,具有很高的营养价值。本文通过分离纯化技术提取河蚬中抗氧化肽,并进一步研究其对化学急性肝损伤的保护作用。研究结果如下:首先以河蚬软体为原料,对其营养成分及营养品质进行了比较和分析。结果表明:河蚬软体部分水分含量为86.64%,干样品中粗蛋白、粗脂肪以及灰分含量分别为62.80%、11.67%和4.82%。样品中有17种氨基酸(557.87 mg/g),氨基酸种类齐全,其中6种必需氨基酸(206.77 mg/g),占氨基酸总量的37.06%,且必需氨基酸与氨基酸总量构成比例达到国际标准要求。河蚬软体中还含有较丰富的矿物质,尤其是Cu和Zn元素均高于常见贝类。综上所述河蚬是一种具有较高营养价值的软体动物。通过对多肽获得率、水解度和DPPH自由基清除能力的测定,确定胰蛋白酶为河蚬的最佳水解酶。以DPPH自由基清除能力作为评价指标,进行水解单因素实验并通过响应面优化工艺参数。最终得到最优酶解条件为:酶解温度45℃、pH值7.5、料液比(w/v)1:7.5和酶加量2020 U/g。在此条件下得到的酶解液DPPH自由基的清除率达到62.22%。河蚬软体水解后,通过超滤系统将多肽分成10 ku、10 ku-5 ku、5 ku三个组分,结果表明5 ku的多肽组分体外抗氧化活性最强。采用Sephadex G-25凝胶层析对分子量小于5 ku的河蚬多肽进一步分离,获得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四组分,通过细胞实验得出组分Ⅰ具有最强的保护HepG-2细胞免受H_2O_2氧化损伤能力,然后利用DEAE阴离子交换层析将组分Ⅰ分为九个组分,其中F_(Ⅰ-3)具有最强的DPPH自由基清除能力,最终利用RP-HPLC纯化得到目标多肽X。通过质谱分析得其分子量为988.3 u,氨基酸序列为KGPAPFYPL。最后,利用CCl_4构建小鼠化学急性肝损伤模型,研究小分子河蚬肽在增强小鼠抗氧化防御系统、抑制促炎症反应和肝细胞凋亡方面的作用。结果表明,小分子肽对小鼠无毒害作用,并且能够降低肝脏指数、提高脾脏指数,减少血清中ALT和AST含量,提高肝脏中SOD和CAT含量,减少MDA含量。通过HE染色、免疫组化实验和TUNEL染色观察,小分子多肽能够明显改善肝脏组织损伤,减少炎症因子的生成,同时抑制化学损伤导致的肝细胞凋亡。综上所述,小分子多肽具有保护肝脏的作用。
【图文】：

实验流程,河蚬

建立小鼠化学急性肝损伤模型，研究河蚬软体小分子多肽对肝损伤的保护作用河蚬药用和功能性食品的开发提供理论依据。.4.2 主要研究内容首先对河蚬软体基本营养成分（水分、蛋白质、脂肪、灰分）和矿物质进行定，并与多种常见淡水和海洋贝类进行分析比较。同时对河蚬软体氨基酸种类含量进行测定，并对氨基酸品质进行分析评价。以短肽获得率、水解度以及 DPPH 自由基清除能力作为评价指标，选出河蚬体最适水解酶。通过单因素实验和响应面优化获得最佳酶解条件。以体外抗氧化能力以及 H2O2氧化损伤 HepG-2 细胞模型作为评价指标，通滤系统、凝胶层析、阴离子交换层析和 RP-HPLC 逐步分离纯化，最终获得目分子多肽，并对目标多肽分子量和氨基酸组成进行测定。建立 CCl4致小鼠化学急性肝损伤模型，从增强小鼠抗氧化防御系统，抑制炎症反应和细胞凋亡方面，研究小分子河蚬软体多肽对小鼠肝损伤的保护作。

水解度,短肽,字母,多肽

短肽获得率、水解度和 DPPH 自由基清除率三个指标确定最解时间、水解温度、pH、酶加量和料液比五个单因素实验前提实验，以 DPPH 自由基清除率为指标确定最优酶解条件。分析剂筛选同酶水解河蚬的短肽获得率和水解度 3.1 可知，胰蛋白酶水解物的短肽获得率为 42.94%，在相同量的情况下，其短肽获得率明显高于其他蛋白酶水解物（P<0.更适合于河蚬软体的水解。从水解度来看，胰蛋白酶具有较强），，这个结果与 Gbogouri 等人[75]研究酶解鲑鱼头部的蛋白质力、乳液稳定性以及 Klompong 等人[76]通过研究不同种类酶蛋白以获取最优抗氧化活性和功能特性相似。这可能是因为胰强酶并且具有最强的水解能力，能够充分发挥酶解作用，水解主要由小分子肽组成。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.1

【参考文献】