黑木耳多糖铁复合物制备、结构表征及其抗缺铁性贫血活性的研究

发布时间：2020-05-12 03:16

【摘要】：铁元素是人体最重要的矿物质元素之一,在人体的循环代谢过程中起着重要作用。世界卫生组织的报告显示,全世界有10-30%的人群具有不同程度贫血症状,而这其中大多数的贫血症状是由缺铁引起的。目前常用亚铁盐如硫酸亚铁、铁富马酸盐和葡萄糖酸亚铁等作为口服补铁剂,然而长期服用上述口服补铁剂时,会引起胃肠道副作用和铁诱导的过氧化应激反应。一些临床研究已经显示长期服用治疗性硫酸亚铁口服剂会引起恶心、呕吐、腹痛和便秘等胃肠道副作用。多糖铁复合物具有稳定性高、水溶性好和副作用少等特点,是一种理想的补铁剂,具有成为抗缺铁性贫血活性药品及保健产品辅料的潜力。黑木耳是一种我国特有的生长在朽木上的黑色腐生菌,作为药食同源的食用菌在1000年前就已开始被广泛食用。我国黑木耳年产量约为650万吨,其中部分因菌种管理混乱、质量不稳定、精深加工不足等问题而造成浪费,增加了产业环保压力,影响产业的可持续发展。黑木耳多糖是黑木耳中重要的功能成分,其具有抗氧化、抗凝血、提高免疫力及抗肿瘤等生物活性,可作为络合铁元素的潜在配体。本研究以黑木耳为原料,采用超声波微波辅助协同提取及分离纯化得到黑木耳多糖,采用改良的三氯化铁法以黑木耳多糖与铁元素复合制备黑木耳多糖铁复合物。然后对黑木耳多糖铁复合物的一般理化特性、结构表征及抗氧化活性进行研究,最后构建缺铁性贫血症大鼠模型,对黑木耳多糖铁复合物进行抗缺铁性贫血活性及急性毒性评价。本研究成果如能在实际工业生产中得以应用发展,不仅可大幅提高黑木耳的附加值,延长黑木耳精深加工产业链,产生巨大的经济、社会及环境效益,还有助于补充市场上补铁补血产品的市场缺口,具有良好的应用价值与广阔的市场前景。研究内容及结果如下:(1)以黑木耳为原料,超临界萃取脱脂后,采用超声波微波辅助协同提取黑木耳多糖,通过单因素试验和响应面优化试验考察料液比、超声波功率、微波温度及协同作用时间对黑木耳多糖得率的影响。结果表明,四个因素对黑木耳多糖得率的影响程度依次为超声波功率料液比微波温度协同作用时间。超声波微波辅助协同提取黑木耳多糖的最佳提取工艺条件为:料液比(g/mL)1:80、超声波功率240W、微波温度85℃、协同作用时间20min,在此条件下黑木耳多糖的得率为9.42±0.12%,采用大孔树脂法对黑木耳多糖进行脱蛋白、脱色素处理,蛋白和色素去除率分别达到80.2±1.12%和87.4±1.25%,多糖损失率为16.6±0.45%。经DEAE-52纤维素柱层析及Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析后,得到黑木耳纯化多糖,命名为AAPS。以凝胶渗透色谱法(GPC)测定黑木耳多糖(AAPS)分子量,得到其重均分子质量(Mw)为1.42×10~6u,数均分子量(Mn)为3.57×10~5u。以PMP柱前衍生高效液相色谱法分析黑木耳多糖(AAPS)的单糖组成,结果表明黑木耳多糖(AAPS)主要是由甘露糖(Man),葡萄糖醛酸(GlcA),葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)四种单糖以不同摩尔比组成,摩尔比为3.62:7.23:12.57:4.24。(2)以黑木耳纯化多糖为原料,制备黑木耳多糖铁复合物,通过单因素试验和响应面试验考察反应温度、反应时间、反应体系pH及柠檬酸三钠添加量四个因素对黑木耳多糖铁复合物含铁率的影响。结果表明,四个因素对黑木耳多糖铁复合物含铁率的影响程度依次为反应体系pH柠檬酸三钠添加量反应时间反应温度。黑木耳多糖铁复合物制备的最佳工艺条件为:反应温度75℃、反应时间75min、反应体系pH9及柠檬酸三钠添加量30mg,在此条件下黑木耳多糖铁复合物含铁率为28.42±0.16%。制备的黑木耳多糖铁复合物(AAPS-iron(Ⅲ))为红棕色无定形粉末,无嗅无味,易溶于水,不溶于乙醇、甲醇等有机溶液。在pH值2.5-12范围内具有稳定性。易吸潮,须在密封干燥条件下保存。铁离子鉴别试验结果表明黑木耳多糖铁复合物(AAPS-iron(Ⅲ))中不含游离的铁离子,黑木耳多糖与铁互相结合而非物理性混合。(3)采用扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度分布仪对黑木耳多糖及黑木耳多糖铁复合物的微观形态进行分析与表征,结果发现黑木耳多糖与铁元素复合后,其微观粒子表面由絮状形态变为片状结构,并且由粗糙变为平整,粒径明显增大。采用热重分析法(TG)对黑木耳多糖及黑木耳多糖铁复合物的热稳定性进行分析,结果发现黑木耳多糖与铁元素复合后,其热稳定性增强,受热后热分解过程由剧烈转为缓和。黑木耳多糖铁复合物在50℃-256℃的温度范围内具有良好的稳定性。采用红外光谱法(FT-IR)、圆二色谱法(CD)、核磁共振氢谱法(NMR ~1H)对黑木耳多糖及黑木耳多糖铁复合物的分子结构性质进行鉴定,结果发现黑木耳多糖与铁元素复合形成了β-FeOOH晶体结构。黑木耳多糖铁复合物核磁共振图谱上除重水峰外,不存在其它明显的共振吸收峰。进一步说明了黑木耳多糖与铁元素互相结合而非物理性混合。黑木耳多糖铁复合物的体外铁元素溶出度试验结果表明,黑木耳多糖铁复合物在模拟的胃肠环境中,铁元素溶出度可达到93.1%,说明其在胃肠道环境中表现出较好的水溶性,有利于铁的吸收,具有良好的生物利用能力。黑木耳多糖铁复合物抗氧化活性试验结果表明,在浓度1.0mg/mL时,黑木耳多糖铁复合物的DPPH自由基清除活性与ABTS自由基清除活性分别达到39.5%、35.9%,其对肝脂质过氧化抑制率达到43.1%。证明黑木耳多糖铁复合物具有良好的抗氧化活性。(4)黑木耳多糖铁复合物高剂量组能使缺铁性贫血大鼠血液中HB、RBC、HCT、MCV、MCH、MCHC的含量逐渐恢复,说明黑木耳多糖铁复合物高剂量组对贫血大鼠具有明显的辅助治疗作用。黑木耳多糖铁复合物高剂量组能使血红细胞内游离原卟啉含量较模型组明显降低,说明黑木耳多糖铁复合物能改善贫血大鼠体内缺铁状况。黑木耳多糖铁复合物高剂量组能明显使血清铁、血铁饱和度含量升高,总铁结合力明显降低。黑木耳多糖铁复合物高剂量组能使动物体重增长明显,一般情况得到改善,动物的外观活动和行为、毛色都逐渐恢复至正常。通过对大鼠肝脏中SOD和MDA含量测定结果分析,高剂量组能显著提升大鼠肝脏内SOD水平,降低大鼠肝脏内MDA含量,表明黑木耳多糖铁复合物具有提高肝组织抗氧化能力及抑制肝组织脂质过氧化的作用。小鼠急性毒性试验结果表明,黑木耳多糖铁复合物最大灌胃给药量为13g/(kg·d),此剂量相当于临床剂量的205倍,给小鼠灌胃后,小鼠体重增值属于正常增长范围,未出现有中毒或者死亡现象,剖检后也没发现组织脏器有明显变化。黑木耳多糖铁复合物的LD_(50)15000mg/kg。综上说明黑木耳多糖铁复合物安全可靠,属于无毒级。
【图文】：

萃取反应,三位一体,单因素试验,紫外

2.2.3.2 超声波微波辅助协同提取黑木耳粗多糖的试验设计准确称取5.00g脱脂黑木耳，使用粉碎机粉碎后过筛得到一定粒度的脱脂黑木耳粉。以一定料液比加入蒸馏水，置于球形冷凝器中，放入反应仪连接（如图2.1所示）。打开的磁力搅拌装置，并设定磁力搅拌速率，启动超声波发生器和微波发生器进行协同提取，反应一定时间后，将提取液以4000r/min使用冷冻离心机在15℃条件下离心20min，弃沉淀，取上清液进行浓缩，将得到的多糖溶液加入4倍体积的80%乙醇溶液，于4℃环境下静置醇沉4小时。然后以4000r/min使用冷冻离心机在15℃条件下离心20 min，弃上清液，取沉淀，分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤沉淀3次，在通风橱内将沉淀低温水浴，使残留有机溶剂蒸发

葡萄糖含量,标准工作曲线,线性方程

入1.0mL的苯酚溶液（5%）及5.0mL的浓硫酸，小心的震荡混匀，25℃水浴半小时，使用紫外分光光度计于490nm波长处检测样品吸光度。以吸光度（A）为纵坐标、葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，绘制标准工作曲线，如图2.2所示。得到的线性方程为：y=0.0018x+0.0025，线性相关系数R2=0.9994，，说明线性方程可信。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS219;TS201.4

【参考文献】