基于HPLC的嘌呤碱基检测方法的建立及海水鱼嘌呤脱除探究

发布时间：2020-05-16 13:41

【摘要】：我国幅员辽阔海产资源丰富,在众多海产品中,鱼肉含有大量高不饱和脂肪酸及优质蛋白因而深受消费者的喜爱,但鱼肉的高营养价值常使消费者忽视其嘌呤含量。现有的检测数据表明海水鱼中嘌呤含量较高,过多的摄入会导致人体嘌呤增多,尿酸水平升高,最终诱发痛风。然而现有的海水鱼嘌呤数据不完善且对海水鱼中嘌呤含量的检测并没有建立统一的国标,因而不能为消费者提供便捷的指导。市场对于低嘌呤食品的开发仅仅局限在游离嘌呤含量较多的啤酒及豆类食品,而对游离嘌呤含量较少的食品尤其是鱼肉的研究较少。因此建立海水鱼的嘌呤含量检测方法,并探寻降低海水鱼中嘌呤含量的有效方法尤为重要。本文以海水鱼为研究对象,通过单因素及响应面实验,确定适宜于海水鱼的嘌呤提取及检测方法。同时以加工方式为辅助手段探究外源添加物-大蒜素对其嘌呤含量的影响并对其脱除机理进行初步探究,以期为完善海水鱼嘌呤值、建立适宜、简便、操作性强的嘌呤脱除方法提供实验基础。主要结论如下:1.分别以甲醇-水、0.02 mol/L KH_2PO_4(pH=3.6)及水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵(V/V/V/V=879:100:15:6)为流动相,并对流动相配比、pH、流速、柱温等条件进行优化,以探寻最适的嘌呤检测方法。结果表明,当0.02 mol/L KH_2PO_4(pH=3.6),水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵(V/V/V/V=879:100:15:6)为流动相时四种嘌呤均可分离。后者峰型及分离度均较优,四种嘌呤可在10 min内基线分离,节省了样品检测时间。此外,使用水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵为流动相能够有效简化流动相的配置过程,降低磷酸盐对色谱柱腐蚀的风险。该流动相条件下四种嘌呤在0.1-300mg/L内线性关系良好,相关系数(R)为1.0000,检出限范围在0.0118-0.0774mg/L之间,精密度RSD%在0.0220-0.7000%之间,四种嘌呤的检出限分别为0.0774(腺嘌呤)、0.0178(鸟嘌呤)、0.0118(次黄嘌呤)、0.0555(黄嘌呤)。2.对超声嘌呤提取法、高氯酸嘌呤提取法及混合酸嘌呤提取法的关键因素:超声时间、温度、酸浓度、水浴时间等进行单因素及响应面实验,通过对比三种方法的嘌呤得率以确定最适嘌呤提取方法。结果表明,三种嘌呤提取法中,超声提取法只能有效提取样品中的游离嘌呤,且提取效果不如酸提取法。而酸提取法中混合酸提取法(甲酸-三氟乙酸)总嘌呤得率优于高氯酸提取法,各组分加标回收率大于94.90%,方法重复性在0.83~1.77%之间。表明该方法简便、可靠、嘌呤损失率小,最终确定为本实验嘌呤提取方法,为下一步海水鱼嘌呤本底值的检测提供了基础。3.采用上述实验确定的最适方法对15种海水鱼不同部位(鱼皮、背部鱼肉、腹部鱼肉、内脏、鱼眼睛)的嘌呤含量进行检测。并模拟海水鱼贮藏条件,探究海水鱼贮藏过程中可食用部分嘌呤含量变化。研究发现在所检测的海水鱼中整体嘌呤总量(背部鱼肉总嘌呤量+腹部鱼肉总嘌呤量+鱼皮中嘌呤含量+内脏总嘌呤量+鱼眼睛总嘌呤量)在414.96-1057.09 mg/100 g之间,嘌呤含量大小依次为海鲈鱼大菱鲆鲅鱼沙丁鱼黄花鱼褐牙鲆带鱼踏板鱼美国红鱼鳕鱼鳗鱼海鲶鱼鳐鱼。此外,对海水鱼可食用部分嘌呤值进行分析发现,可食用部分嘌呤值在306.40-812.23 mg/100 g之间均属于高嘌呤食品。在-18℃贮藏过程中,样品腺嘌呤、鸟嘌呤变化无显著规律,次黄嘌呤含量在短时间内迅速升高后降低至平缓,黄嘌呤变化虽不明显,但也有缓慢升高至平缓的趋势,这可能与水产品死后ATP变化及其他酶促反应有关。4.采用浸泡、水煮、浸泡-水煮三种方式对样品进行处理,结果显示:三种处理方式中浸泡-水煮的嘌呤脱除效果最佳,其中鱼肉、鱼皮总脱除率可达70.35%以上。以加工方式为辅助手段,探究外源添加物对嘌呤脱除的影响。结果表明在加工过程中加入大蒜能够进一步降低海水鱼中的嘌呤含量,此外,分子对接结果显示大蒜主要成分大蒜素可与黄嘌呤氧化酶的SER1080、ALA 1079形成氢键,与MET 1038、PHE 914、ALA 910形成疏水键,且LibDock Score可达74.21,表明其与黄嘌呤氧化酶具有较强的结合潜力。黄嘌呤氧化酶活性测定实验结果表明大蒜素可提高其活性,并以此促使次黄嘌呤向黄嘌呤转化,因而推测在浸泡处理过程中大蒜素通过氢键、疏水作用与黄嘌呤氧化酶结合,提高了黄嘌呤氧化酶活性,从而促进了次黄嘌呤向黄嘌呤转化。此外,大蒜素(pH7)可为反应提供酸性环境,改变黄嘌呤热稳定性。因而在水煮过程中实现对黄嘌呤和次黄嘌呤的同时脱除,提高最终脱除率。
【学位授予单位】：渤海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.72;TS254.7

【参考文献】