包装中DEHP对MCF-7细胞毒性效应及其检测标志物的研究

发布时间：2020-05-17 20:25

【摘要】：DEHP(邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯)作为邻苯二甲酸酯家族使用最广泛的塑料增塑剂,常用于增加塑料包装的塑性和韧性。但是随着时间延长,塑料包装中的DEHP会因迁移溶出而造成食品污染,干扰人体内分泌系统。本文以塑料包装材料中的DEHP为研究对象,基于细胞替代毒理技术,选取MCF-7细胞为试验模型,在从代谢组学角度研究DEHP对MCF-7细胞的内分泌干扰毒性作用的基础上,同时筛选出差异性代谢产物作为生物标志物,为今后食品包装中DEHP迁移分析提供新的快速有效的检测方法。本文首先开展了MCF-7细胞在DEHP 10-9-10-2 mol/L 8个剂量的细胞活性实验,暴露时间分别为24 h和48 h。其中,不同剂量的DEHP暴露24 h,细胞活性在81.9%-260.7%之间;不同剂量的DEHP暴露48 h,细胞活性在95.8%-23 7.7%之间。根据上述剂量对细胞活性的影响,开展特定剂量10-6 mol/L DEHP暴露于MCF-7细胞的代谢组学研究。具体包括建立细胞中小分子代谢产物的非靶向筛查方法,筛查了细胞中近400种小分子代谢产物。根据变量中VIP值1,结合t-test P值0.1,筛选得到MCF-7细胞暴露于10-6 mol/L DEHP至48 h后的13种差异代谢物,包括氨基酸及其衍生物、有机酸、核苷酸、脂类等代谢产物,并且通过富集分析回溯到相关代谢通路,发现代谢产物的变化与9条代谢途径有关,其中核黄素代谢、β-丙氨酸代谢、氮代谢和组氨酸代谢为主要的4条代谢通路。此外,选取了差异性代谢产物中8种主要参与4条代谢通路中的小分子化合物,建立其在MCF-7细胞中的定量检测方法。采用质量控制样本进行PCA分析,说明方法的稳定性良好。运用所建方法对受DEHP污染的细胞样本进行检测,进一步验证非靶向筛查结果,筛选了8种代谢产物中最具差异性的3种代谢产物包括胞嘧啶、y-L-谷氨酰-L-缬氨酸、2-羟基腺嘌呤以及相应的上下调趋势。上述3种物质可作为DEHP的生物标志物用以评价食源性DEHP污染情况。
【图文】：

MCF-7细胞,细胞活性,培养箱,空白

避免孔板置于培养箱中培养时因挥发造成体积不准确而产生误差。8 检测细胞活性 CCK8 试剂盒测定细胞活性，药物处理 24 h、48 h 后，，取出孔板每孔加入试剂后，再转移至培养箱内，继续培养两个小时。在加完试剂后将板晃 30 s，采用酶标仪于 450 nm 波长处测定光密度值（简称 OD 值），胞存活率=（实验孔 OD 值-空白孔 OD 值）/（对照孔 OD 值-空白孔去空白孔 OD 值用以消除酚红和血清的影响。与分析果表明，在 5%无激素 FBS 处理条件下，细胞活性有明显变化。低浓度0-8-10-4mol/L）处理组从 24 h-48 h 逐渐表现出增殖效应（图 2-1）。高浓度0-3-10-2mol/L）处理组在 24 h 内即表现出增殖，浓度越高增殖效应越强-7 细胞活性增加 2-3 倍，并且随染毒时间的延长，增殖效应逐渐减弱。上研究一致[67]，但本文涵盖了更广的浓度范围，特别是在 10-3-10-2mol/L

正离子,总离子流,样本,模式

包装中 DEHP 对 MCF-7 细胞毒性的非靶向代谢组学分析辅助气压：55 Psi，气帘气压：35 Psi，温度：600℃，离子式）或-4000 V（负离子模式）。原始数据通过ProteoWizard 软件转成XCMS 可以识别的留时间进行矫正，并进行峰检验工作包括峰对齐、提取、台和自建二级质谱数据库进行物质鉴定。多元变量统计分 PCA 分析、OPLS-DA 分析、VIP 值及 P 值分析等。使富集网站 MetaboAnalyst 对代谢物进行通路富集分析。
【学位授予单位】：西安理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS206.4

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