D-来苏糖异构酶的性质鉴定及在单糖生物转化中的应用

发布时间：2020-05-28 01:41

【摘要】：D-甘露糖是D-葡萄糖C-2位的差向异构体,也是D-果糖的醛糖异构体。它具有益生元活性,可参与免疫调节,也可作为工业化生产功能性甜味剂甘露醇的原料。L-核糖是D-核糖的对应异构体,是一种稀有糖。作为一种重要的医药中间体,L-核糖可合成具有抗人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒和肝炎病毒活性的L-核苷类衍生物。近年来,D-甘露糖和L-核糖的生物合成受到了国内外学者的极大关注。D-来苏糖异构酶(D-Lyxose isomerase,EC 5.3.1.15)是一种醛糖-酮糖异构酶,可催化多种单糖之间的异构化反应,包括D-木酮糖和D-来苏糖,D-果糖和D-甘露糖以及L-核酮糖和L-核糖等。本课题主要研究了来源于嗜热细菌Peptococcus bacterium 1109的D-来苏糖异构酶,并分别构建了D-葡萄糖异构酶和该酶的共表达体系,实现从D-葡萄糖一步法生产D-甘露糖,以及L-阿拉伯糖异构酶和该酶的共表达体系,实现从L-阿拉伯糖一步法生产L-核糖,探索经济制备D-甘露糖和L-核糖的有效途径。来源于P.bacterium 1109的编码D-来苏糖异构酶基因片段的GenBank登录号为KLU40859.1,全长543 bp。克隆该片段,并将其连接至pET-22b(+)载体上构建重组质粒,导入E.coli BL21(DE3)中,加入IPTG诱导酶过量表达,使用镍离子亲和层析分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测结果显示蛋白分子量约为21 kDa,与理论分子量结果相一致。凝胶排阻色谱结果显示蛋白全分子量约为42 kDa,推测重组酶为同源二聚体。P.bacterium 1109 D-来苏糖异构酶的最适pH为7.5,最适温度为70℃,Co~(2+)可以显著提高其活力。该酶在70℃和75℃下比较稳定,最适底物为D-来苏糖,对D-果糖,D-甘露糖,L-核糖均有催化活性。以D-果糖为底物时,重组D-来苏糖异构酶的比酶活可达2.5±0.2 U/mg。以500 g/L的果糖为底物,在最适条件下反应8 h达到平衡,得到D-甘露糖96.0 g/L,平衡转化率19.2%。将来源于Acidothermus cellulolyticus的D-葡萄糖异构酶和P.bacterium 1109 D-来苏糖异构酶的编码基因分别连接至质粒pCDFDuet-1上,构建重组共表达质粒并导入E.coli BL21(DE3),进行发酵培养。重组共表达细胞可利用D-葡萄糖生产D-果糖和D-甘露糖,体系的最适反应条件为pH 6.0和70℃,最适金属离子为Co~(2+),在60℃及以下具有较好的热稳定性。以500 g/L的D-葡萄糖为底物,可得到185.0 g/L的D-果糖和62.6 g/L的D-甘露糖。构建Alicyclobacillus hesperidum L-阿拉伯糖异构酶和P.bacterium 1109 D-来苏糖异构酶的共表达体系,研究重组共表达细胞利用L-阿拉伯糖产L-核酮糖和L-核糖的能力。该体系的最适反应条件为pH 6.5和65℃,最适金属离子为Co~(2+),50℃时具有一定的热稳定性。以500 g/L的L-阿拉伯糖为底物,可得到85.6 g/L的L-核酮糖和45.9 g/L的L-核糖。
【图文】：

图 1-1 D-甘露糖结构式Fig. 1-1 Structure of D-mannose（A）α-D-甘露吡喃； （B）β-D-甘露吡喃界，甘露糖通常以甘露聚糖或半纤维素的组分形式存在[13]。茶籽清球蛋白、卵类粘蛋白和一些真菌中含有甘露聚糖，咖啡渣中的[9]。甘露糖在柑橘皮等植物果皮中为游离状态。桃、苹果类水果。甘露糖添加到食物体系中，可以和体系中的蛋白质发生美拉德]。尽管甘露糖在人体内的浓度小于葡萄糖浓度的五十分之一，但程中起着十分重要的作用[15]。糖的生理功能及应用作为功能性甜味剂，具有益生元功能[16]。D-甘露糖是人体内生物糖蛋白的一个重要的代谢中间产物，当其进入人体后，血糖浓度直接被转化为糖原储存能量利用[17-19]。单独服用甘露糖可以抑制鼠的肿瘤生长，结合化疗药物服用甘露糖后，能够增强针对多种-甘露糖可以通过对 T 细胞的免疫调节进而抑制 I 型糖尿病和肺

的方法将混合糖浆分离，，收集分离液可直接得到纯度 90%以上的 D-甘露糖。1.2.3.3 生物法制备 D-甘露糖甘露糖的生物法制备主要以D-果糖为原料，利用单糖异构来实现（图1-2），也有少数报道以D-葡萄糖为原料差向异构化生产甘露糖。D-甘露糖异构酶（EC 5.3.1.7）、纤维二糖差向异构酶（EC 5.1.3.11)和D-来苏糖异构酶（EC 5.3.1.15）都具备D-甘露糖生产能力。但是，目前鉴定的D-甘露糖异构酶大多催化效率不高，且最适反应温度较低，在30°C至60°C之间。Hu等[45]克隆了来源于E.coli BL21的mRNA酶编码基因（yihS）在枯草芽孢杆菌WB800中表达，在45°C，pH 7.0的条件下，以D-果糖为底物，可实现约为25%的D-甘露糖转化率。Takasaki等[46]利用来源于Pseudomonas sp.的D-甘露糖异构酶
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS218

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本文编号：2684496